铁死亡相关基因在转移性骨肉瘤中的作用机制

童 也，周浩远，赵 鹏，徐海栋

0 引 言

骨肉瘤是临床上最常见的恶性骨肿瘤，多见于儿童和青少年[1]。虽然手术联合新辅助化疗显著提高了局部肿瘤患者的5年生存率，但大部分的骨肉瘤患者都会发生转移，转移性骨肉瘤患者的5年生存率只有20%～30%[2-3]。目前，骨肉瘤仍是青少年发生癌症相关死亡的第二大因素[4-5]。

铁死亡是一种调节细胞死亡的新形式，以产生并积累铁依赖性脂质活性氧为特点的细胞氧化性死亡[6]。据报道，铁死亡与脂质代谢之间的相互作用在肿瘤发生发展，侵袭、转移、耐药性和肿瘤免疫中发挥重要作用[7]。此外，在多种类型的具有耐药性的癌细胞中，尤其是具有间充质和去分化特征的癌细胞更容易受铁死亡的影响[8-9]。最近的研究发现，HMOX1的过表达能够增加骨肉瘤细胞对EF24的敏感性，而EF24作为铁死亡的启动子，可以通过增加细胞脂质过氧化水平、细胞内铁浓度和活性氧来触发骨肉瘤细胞的铁死亡[10]。因此，铁死亡相关基因有希望成为骨肉瘤治疗新的潜在靶点。而本研究从GEO数据库中获取了转移性骨肉瘤组织样本数据，探讨铁死亡相关基因在转移性骨肉瘤中的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1数据获取与处理从GEO数据库(Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载3个芯片数据集GSE21257(34个转移骨肉瘤样本，19个非转移骨肉瘤样本)、GSE14827(9个转移骨肉瘤样本，18个非转移骨肉瘤样本)和GSE32981(18个转移骨肉瘤样本，5个非转移骨肉瘤样本)，其对应的平台文件分别为GPL10295、GPL96和GPL3307。在R软件中， GSE21257的芯片表达矩阵文件基于log2进行对数转换，GSE14827与GSE32981的原始芯片数据通过affy包做背景校正和标准化处理。此外，从GSE21257的临床数据中提取骨肉瘤患者的临床信息以进行后续的生存分析和多因素Cox回归分析。

1.2差异分析与GSEA通过limma包筛选GSE21257中骨肉瘤转移组与非转移组间的差异表达基因(differential expression genes, DEGs)，差异倍数的绝对值(|log2Fold Change|)> 0.5以及P值 < 0.05设为DEGs的筛选条件。clusterProfiler包[10]用来对DEGs进行GSEA，包含GO富集分析和KEGG代谢通路富集分析，P值 < 0.05作为筛选的阈值。

1.3铁死亡相关的DEGs的分析从既往的文献中，共收集了259个铁死亡相关的基因[12]。将上述得到的DEGs与这259个铁死亡相关的基因取交集，得到铁死亡相关的DEGs。基于表达量的中位数，将铁死亡DEGs分为高、低表达组，结合其对应的临床生存数据，通过survival包对铁死亡DEGs进行生存分析，以P值<0.05进一步筛选与骨肉瘤得到预后相关的铁死亡DEGs。此外，基于sva包对GSE14827与GSE32981数据进行批次校正与合并，在合并后的数据集中对预后相关的铁死亡DEGs进行验证。最后，结合患者的临床信息构建多因素Cox回归模型，筛选能作为骨肉瘤独立预后因素的铁死亡相关基因。

1.4统计学分析采用R软件(4.0.1)进行差异分析及基因集富集分析，计量数据分析采用t检验和多重假设检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1差异表达基因在GSE21257中，转移组与非转移组骨肉瘤样本中共筛选出632个DEGs，其中上调的基因298个，下调的基因334个。

2.2GSEA结果GO富集分析结果表明DEGs主要富集生物学过程有适应性免疫应答、细胞激活、免疫反应相关的细胞活化以及防御应答，见图1。KEGG富集分析的结果发现共有17条通路被DEGs显著富集。其中，细胞周期和亨廷顿病通路整体处于激活状态，趋化因子信号通路、TOLL样受体信号通路等15条代谢通路整体处于抑制状态。见图2。

2.3铁死亡DEGs的分析与验证全部的DEGs与259个铁死亡相关基因通过取交集，共得到11个铁死亡DEGs，分别有HSPB1、CISD1、FANCD2、ATF4、FH、TMBIM4、PLIN2、ALOX5、TLR4、MTDH和TXNIP。见表1。生存分析的结果表明，FANCD2、HSPB1和ATF4高表达的骨肉瘤患者整体生存率显著低于低表达的骨肉瘤患者，而TMBIM4高表达的骨肉瘤患者整体生存率显著高于低表达的骨肉瘤患者(P<0.05)，见图3。在合并后的数据集中对FANCD2、HSPB1、ATF4和TMBIM4在转移、非转移组骨肉瘤样本中的表达进行验证，结果表明ATF4、FANCD2和HSPB1在骨肉瘤转移组中的表达显著高于非转移组，TMBIM4在骨肉瘤转移组中的表达显著低于非转移组(P<0.05)，与GSE21257中差异表达的调节趋势一致，见图4。结合临床信息并纳入上述4个基因进行多因素Cox分析，发现FANCD2是骨肉瘤的预后的危险因素(P<0.05)，见图5。

a:适应性免疫应答; b:细胞激活; c:免疫反应相关的细胞活化; d:防御应答

表 1 骨肉瘤样本铁死亡DEGs在GSE21257中的表达

图 3 骨肉瘤患者铁死亡DEGs的生存分析

a:AFT4; b:FANCD2; c:HSPB1; d:TMBIM4

图 5 骨肉瘤多因素Cox回归模型的森林图

3 讨 论

鉴于骨肉瘤的易转移性和高度侵袭性，10%～20%的骨肉瘤患者在首次临床就诊时就能检测到转移灶[13-14]。骨肉瘤最常见的转移部位就是肺，而发生肺转移的骨肉瘤患者复发率高达80%，这严重的威胁了骨肉瘤患者的生存和预后[15,16]。在本研究中，首先从GSE21257中筛选出转移性与非转移性骨肉瘤组织中的DEGs。对全部的DEGs进行基因集富集分析，GO富集分析的结果表明DEGs主要参与的生物学过程有免疫应答、防御应答以及细胞激活。而在KEGG富集分析的结果中，本研究发现细胞周期通路整体处于激活状态。细胞周期和凋亡蛋白密切相关，细胞中任何不可逆的损害进入细胞周期时通常会触发凋亡[17]。而转移性骨肉瘤组织中细胞周期通路的的进一激活，极大的抑制了骨肉瘤细胞的凋亡，从而加速了骨肉瘤的进展。

本研究对全部的DEGs以及259个铁死亡相关的基因取交集，找出了11个铁死亡DEGs，包含HSPB1、CISD1、FANCD2、ATF4、FH、TMBIM4、PLIN2、ALOX5、TLR4、MTDH和TXNIP。这11个基因的生存分析结果表明，FANCD2、HSPB1、ATF4的高表达和TMBIM4的表达降低与骨肉瘤患者的总体生存时间的降低有关。FANCD2是范可尼贫血(fanconi anemia，FA)途径中的核心蛋白，FA基因的突变会导致FANCD2的单泛素化缺陷[18]。据报道，FANCD2的过表达与淋巴结阳性的大肠癌关联密切，FANCD2蛋白在调节与肿瘤发生，凋亡和其他与重要生命过程有关基因的表达中起重要作用[19-20]。有研究表明，在MG-63细胞中通过siRNA-FANCD2沉默FANCD2后，细胞的增殖受到抑制，细胞周期发生停滞并可诱导细胞凋亡[21]。此外，FANCD2可以通过在多个水平上调节铁代谢和脂质过氧化来抑制铁死亡从而保护骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)。缺乏FANCD2的BMSCs表现出铁过载、铁摄取的基因表达增加、铁贮藏的基因表达减少以及铁输出[22]。因此，在转移性骨肉瘤组织中，抑制FANCD2的表达对于诱导骨肉瘤铁死亡相关的细胞凋亡可能具有重要意义。HSPB1是热休克蛋白家族成员, 主要功能是促进应激条件下的细胞稳态，而HSPB1的过表达与肿瘤发生，转移和侵袭性密切相关[23-24]。HSPB1已被证实是一种诱导癌细胞铁死亡的负调节剂，在体外和体内抑制HSPB1的表达增加了铁死亡诱导剂介导的癌细胞铁死亡，同时磷酸化的HSPB1可以充当负调节剂从而减少细胞铁的摄取和脂质过氧化的产生来促进铁死亡[25]。激活转录因子4 (activating transcription factor 4, ATF4)作为一种应激诱导的转录因子，在多种癌症中表达上调，并与蛋白酶体抑制剂和化疗药物耐药有关。已有的研究表明，ATF4和MYC表达的增加可以诱导多种骨肉瘤细胞系的粘附力下降，促进细胞的脱落和转移[26]。包含Bax抑制因子的跨膜序列4(transmembrane 92 Bax inhibitor-1 motif-containing protein 4，TMBIM4)，通常被认为是管家蛋白，在所有人类组织中普遍表达，目前仍没有相关研究表明该基因在骨肉瘤中发挥的作用。本研究的结果表明，与骨肉瘤非转移组相比，FANCD2、HSPB1和ATF4在OS转移组中的表达都是上调的，而TMBIM4在骨肉瘤转移组中的表达是下调的，在另外的合并数据集中进行验证，其表达调节也与之一致。多因素Cox回归分析结果提示FANCD2有能力作为骨肉瘤预后的危险因素。

综上所述，本研究提示FANCD2、HSPB1、ATF4和TMBIM4作为铁死亡相关的基因，在转移性骨肉瘤组织中的表达异常可能会减少细胞铁死亡相关的细胞凋亡，从而促进骨肉瘤的疾病进展，但由于本研究是基于生物信息学方法来进行分析与解读，确切的结论仍需要进一步的实验来进行佐证。