光遗传学在治疗神经内科疾病中的研究进展

王运茜，薛清萍，冯曦兮，邢国刚，徐 帆*

（1. 成都医学院公共卫生学院，成都 610500；2. 北京大学医学部基础医学院，北京 100091）

自2002 年国外有实验室首次用光受体蛋白来调控神经活动取得成功以来，光遗传学技术便迅速地走进人们的视野。光遗传学是光学和分子遗传学交叉融合的产物，在医学领域广泛应用于研究各类疾病的发病机制与治疗方法，其中研究最多的是神经功能方面的疾病。近年来，随着该技术的发展，一系列有关光遗传学的科学研究与相关技术应用层出不穷。光遗传学技术俨然成为研究神经科学的重要手段。

1 光遗传学的发展简史

光遗传学最早起源于神经科学，是一种利用载体将光敏感蛋白植入可兴奋的动物神经元中，然后光照受体蛋白，从而达到控制神经元、影响生物体生理活动的研究方法。

该研究方法萌芽于1979 年。美国著名科学家克里克（Francis Crick）在Thinking about the brain中提出，在不损伤其他神经元的情况下，开发出一种新的技术，精确控制特定的大脑神经元，以进一步开展大脑神经科学领域的研究［1］。2002 年，奥地利神经科学家米森伯克（Gero Miesenböck）和其实验室成员将果蝇的视紫红质基因植入海马神经元标本中，再使用光照激活受体蛋白，最后成功控制了神经元的活性［2］。这是历史上体外光控神经元取得的首次成功。米森伯克由此被视为光遗传学领域的开拓者之一。随后，《自然神经科学》杂志在2005 年9 月刊登了一篇光遗传学领域的开山之作——《毫秒时标，神经活动的基因靶向光学控制》。在这篇文章中，研究人员利用光照调控视蛋白，精确控制了生物体的大脑神经元，并且还证实了植入的光敏感蛋白——通道蛋白视紫红质2（channelrhodopsin-2，ChR2）对细胞功能无任何损害作用［3］。紧接着，Diesseroth 等［4］为描述此种，将光学与遗传学操作相结合，从而实现对特定神经元活性精准控制的研究手段，并在2006 年首次提出了光遗传学这个词语。

光遗传学技术是在光遗传学研究上发展出来的新兴技术。该技术通过向靶细胞内导入光敏蛋白基因，再利用光纤导入或向大脑内植入发光二极管的方式照射光敏感蛋白，从而实现对神经元的激活或抑制，最后可观察神经电生理的改变［5］。

2 光敏感蛋白的发现

2.1 细菌视紫红质（BR）

实现光遗传学技术的其中一个关键步骤为光敏感蛋白的发现和使用。细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR）首先被描述为一种单组分跨膜（transmembrane，TM）蛋白，能够将质子从细胞内空间转移到细胞外空间［6］。早在1971 年，Oesterhelt等［7］借鉴青蛙视紫红质的研究方法，首次在古细菌盐藻细胞膜中发现了视紫红质，因此其又被称为古细菌视紫红质。由于在细菌和动物体内都发现了视紫红质，所以其被重新定义为一种动物和微生物体内含有视网膜生色团的光活性蛋白质。1973 年，Oesterhelt 等［8］发现光照BR 能够引起氢离子外流，从而证实了其为一种光驱向外质子泵。因其通过光照可改变细胞膜内外电位差，所以BR 可作为光遗传学控制靶细胞的一种工具。

2.2 嗜盐菌视紫红质（HR）

1977 年，Matsuno-Yagi 等［9］又在古细菌中发现了嗜盐菌视紫红质（halorhodopsin，HR），也称氯视紫红质或盐细菌视紫红质。Schobert 等［10］在1982 年发布的研究表明，HR 是一种由光驱动的氯离子泵，此发现与之前提出的HR 是一种向外驱动钠离子泵截然不同。HR 与BR 作用原理相同，均为超极化反应，但其吸收560～580 nm 的黄光。光遗传学技术发展至今，科学家们在盐藻和细菌中发现BR 和HR后，相继在真菌和其他微生物中也发现了多种视紫红质［6］。这些视紫红质统称为微生物视紫红质。

2.3 通道蛋白视紫红质（ChRs）

2002 年，Nagel 等［11］又在莱茵衣藻中发现了第三类电导调节的微生物视紫红质——通道蛋白视紫红质（channelrhodopsins，ChRs）。它是一种光门控阳离子通道，可通过不同波长光的刺激来控制阳离子进入细胞，改变膜内外电位差，从而达到膜去极化的作用［12］。2002 年在莱茵衣藻中发现的通道视紫红质1（channelrhodopsin-1，ChR1）是第一个被鉴定的ChRs，其主要介导氢离子的传递［11］。但由于其导电性低，故并不适合作为光敏蛋白。次年，通道视紫红质2（channelrhodopsin-2，ChR2）的生物功能也逐步被探索出来［13］。经过证明，ChR2 只需要简单的光照就可以让细胞产生去极化作用。近几年来，研究人员不断探索微生物视紫红质，在ChR1 或ChR2 的结构基础上不断改进。2013 年，Govorunova等［14］发现了最大吸收波长在445 nm 处的PsChR。该视蛋白比ChR2 对钠离子选择性更强，对光更加敏感。ChRGR（ChR-green receiver）是在ChR1 的结构基础上进行改进得到的嵌合体蛋白分子，具有最小的脱敏特性和灵敏的动力学特征［15］，有望被应用在光遗传学研究中。

除以上两种改良蛋白外，目前还发现了C1V1（ChR1/VChR1 Chimera）、ReaChR、CnChR1（Chrimson）、ChRFR（ChR-fast receivers）、ChIEF、ShChR（hronos）等ChRs 类视蛋白［16-20］，这些通道蛋白的出现使光遗传学技术在科学探究上更进了一步。ChRs 现已成为应用最多、研究最广的微生物视紫红质。

图1 微生物视紫红质的功能Fig. 1 Function of bacteriorhodopsin

3 光遗传学的临床研究发展现状

3.1 脑卒中

脑卒中是一种急性脑血管疾病，也是严重危害人类健康的神经性疾病之一［21］。其发病机制是脑部血管突然破裂，或者因血管阻塞导致血液不能流入大脑，从而引起脑组织损伤。目前临床上治疗脑卒中的方法有药物治疗、血管内治疗、脑细胞移植、脑刺激法和经颅光生物刺激疗法等［22］。其中脑刺激法直接靶向调控致病区神经元，可细分为经颅直流电刺激、经颅磁刺激、硬膜外刺激三种。传统脑刺激法能激活或者抑制致病区的所有神经元，因而我们无法准确定位具体调控脑卒中发生与恢复的细胞。且使用该方法对患者身体会产生一定的副作用。治疗时，脑刺激法敌我不分，一些正常的神经元也会被攻击，从而受到损伤，导致术后出现头晕、精神亢奋等症状。经颅光生物刺激疗法的原理是使用低功率激光直接照射头部，或者开颅后将激光运输到受伤脑组织，通过光照活化细胞色素c 氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）后，CCO 发生一系列二次事件来调控细胞。它的作用原理与光遗传学研究方法相似，但在精确调控细胞方面又显示出不足，且目前尚不清楚用多大功率的光能透过某处大脑实质产生生物效应。已有的研究显示，光遗传学技术能够通过刺激缺血周围区域神经元，如光生抑制纹状体γ-氨基丁酸能神经元（GABAergic neurons），以改善组织状况［23］、精确调控靶细胞，并弥补光刺激法的不足。而在脑缺血小鼠模型中，通过使用光遗传技术调控运动区的不同回路已经实现了运动功能的恢复［24］。目前，科学家们已探索出大脑中与脑卒中致病机制及恢复相关的一些靶向区域，如同侧运动皮质、不同的皮质脊髓回路和神经源性小生境脑室下区等，为将光遗传学进一步应用于脑卒中的临床治疗提供了可能的研究方向。

3.2 帕金森病（PD）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界上第二大神经系统退行性疾病，多发生于老年人。该病主要表现特征为动作缓慢、肌肉僵硬，以及肢体或者身体其他部位静止性震颤，同时还伴随有认知功能障碍和自主神经功能紊乱等问题［25］。PD 的主要致病机制是大脑黑质密部多巴胺神经元丢失，但目前并不清楚引起多巴胺神经元丢失的原因［26］。现阶段PD 患者主要依靠药物治疗，但始终达不到彻底根治的效果，还会产生药物耐受等副作用。因此，我们需要寻求一种新的治疗方法，能够突破传统治疗方法的局限，针对病症治标治本。光遗传学技术的出现为治疗PD 带来了曙光。Kravitz 等［27］发现光刺激纹状体直接通路中间投射神经元能明显改善小鼠的僵硬、运动缓慢的行为，说明基底神经节回路能调节PD 的运动症状，直接通路中间投射神经元与PD 运动症状的发生有关。这个发现表明，纹状体可作为临床上治疗PD 运动症状的靶点。

2010年，Bass等［28］在试验中利用光遗传学技术控制多巴胺神经元的离子通道，以此来精确控制多巴胺的释放。通过此种方法治疗PD，不仅避免了药物带来的运动障碍等副作用，而且不会损伤其他不相关的神经元。PD 功能认知障碍是一种非运动症状。早前有临床数据表明，蓝斑去甲肾上腺素能神经元（locus coeruleus norepinephrine neuron，LC-NE）与之密切相关［29-30］。2012 年，Vazey 等［31］将光敏感蛋白植入LC-NE 中，并利用光刺激整合了光敏感蛋白的LC-NE ，结果表明其能够调节对外观环境的感知。因此，光遗传学技术被认为在治疗PD的运动症状与非运动症状方面上均有较好的应用前景。

3.3 癫痫

癫痫是大脑神经元突发性同步异常放电导致短暂的大脑神经功能障碍的一种慢性脑部疾病［32］。其发病主要原因是神经元回路的兴奋与抑制失调。发作时，异常兴奋的神经元处于动态中，因此有针对性的精确控制神经元活动的时间显得较为困难［33］。现阶段癫痫的主要治疗方法有药物治疗、手术和电刺激疗法。临床上常用的治疗方式为药物治疗。这种治疗方法能控制大部分癫痫患者的发病，但由于药物是多靶点治疗，在治疗致病细胞的同时也会损伤其他神经元［34］。此外，还有少部分患者发展成为耐药性癫痫，药物对其作用效果不明显。光遗传学作为能精准控制细胞的崭新技术，为治疗癫痫开辟了一条新通道。

目前，利用光遗传学技术治疗癫痫的原理主要是调节抑制性中间神经元活性和兴奋性锥体细胞［35］。NpHR（natromonas pharaonis halorhodopsin）是一种氯离子泵，属于HR 类光敏感蛋白，能引起细胞产生超极化反应。2009 年，Tonnesen 等［36］在体外建立海马区癫痫模型，并且将NpHR 植入海马锥体细胞和颗粒细胞内，利用黄光照射，最后证明了光控NpHR 能缩短癫痫发作的时间。该试验为光遗传学技术治疗癫痫提供了依据。Sukhotinsky 等［37］在2013 年又通过体内癫痫模型——活大鼠海马区椎体神经元植入eNpHR3.0，证实了光照能延缓癫痫持续状态的潜伏期。试验结果显示，光遗传学治疗在一定程度上可减轻癫痫症状。同年，Selvaraj 等［38］报道，使用开环光生控制能抑制癫痫样活动发作。他们使用ChR2 研究了脉冲和恒定光照对离子通道电导的影响，结果显示，光生通道的固有特性确保了大脑皮层的电荷平衡，抑制细胞群是开环控制的目标，从而使癫痫发作波被成功地抑制。从目前多个研究结果来看，光遗传学治疗癫痫的可行性在于其能精确控制靶细胞活性以及在时间上的高效把控，且使用光刺激调控细胞的反应能在毫秒内发生，无需等待其他介质的传递。

4 总结与展望

通过本篇综述，我们着重讨论了光遗传学技术治疗脑卒、PD 和癫痫的研究进展。从以上所述的研究现状来看，光遗传学在神经内科疾病中的应用目前正处于探索阶段，仅限于实验室的研究，暂时还不能直接应用到疾病的诊断和治疗中。不可否认的是，光遗传技术目前也存在许多尚未解决的问题。如有限的细胞特异启动子直接决定了病毒载体运送的光敏基因调控的细胞种类，因此，如何将光敏基因通过病毒载体植入细胞并得到高表达性，还需要更多的研究去突破。同时，在临床应用上，使用的病毒载体对人体产生的细胞毒性和免疫应答反应的程度、病毒载体的长期转染对大脑的影响、递送载体的替代和改良，以及设计出能够安全插入大脑的探针等，都还需要不断研究、优化。再者，光遗传学作为近年来一个新兴的跨越学科的研究技术，目前迫切需要掌握多门学科知识和技能的复合型研究人才对其进一步开发利用，这一限制也是这个领域的一大挑战。

但相比其他治疗神经损伤的技术，这项新兴技术最大的优势在于精准调控特定细胞和精确把控时间这两方面，打破了传统治疗神经内科疾病的种种局限性，如传统药物治疗时间长、效果不明显且副作用大，电刺激法波及神经元范围广等缺点。同时，目前使用的传统方法治疗神经内科疾病不仅费用昂贵，多数家庭难以承受，而且预后效果欠佳，只能改善而不能阻止病情的发展，病人也因此有了严重的心理负担，从而影响患者的生命质量。以光遗传学技术作为新的突破口，这项近似无创治疗的技术能降低开颅手术带来的风险，且没有副作用，从生理上和心理上都能极大地减轻患者的痛苦。选择性的靶向治疗也增大了治愈的可能性，甚至可能彻底根治疾病，提高患者的生命质量。光遗传学理论和技术体系的建立，不仅是科技创新的一大重要成果，更为治疗疾病提供了一种全新且更为精准的思路和方法。随着越来越多的疾病发病机理被揭示，光遗传学技术将会被应用到更多的疾病中去，尤其是与神经科学领域相关的疾病治疗。目前已有大量研究表明［39-42］，光遗传学技术在抑郁症发病机制、心脏电生理、疼痛、睡眠焦虑、肿瘤、视网膜疾病、运动障碍、听觉研究和成瘾机制等研究领域有了新的突破，有望被应用于治疗这些疾病。光遗传学不仅为人们打开了精准控制神经元的新视野，同时也在疾病病理和治疗方面提供了全新的方法，以帮助我们对自身健康和疾病进行更深层次的探索。