光学相干成像技术无创监测Er:YAG激光消融后人牙本质表面变性层

曾素娟，蓝银涛，高伟健，黄文燕，舒 焱，葛立宏*，张 建*

（1. 广州医科大学附属口腔医院儿童口腔科，广州市口腔再生医学基础与应用研究重点实验室，广州 510182；2. 广州医科大学基础医学院生物医学工程系，广州 511436）

1997 年，掺铒钇铝石榴石（Er:YAG，简称“铒”）激光获得食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准，作为牙体硬组织的激光应用于临床。其波长为2 940 nm，在水及羟基磷灰石OH-的吸收峰附近。水吸收激光能量后瞬间汽化，体积剧烈膨胀，产生微爆破，从而达到去除组织的效果［1］。由于龋坏组织的含水量高于健康组织，Er:YAG 激光能选择性地去除龋坏组织。与传统涡轮机相比，其在牙体预备过程中不接触组织、无震动、噪声小，对硬组织有镇痛作用，使患者更舒适，减少患者的焦虑，尤其适用于牙科恐惧症的患者［2］。Er:YAG 激光消融硬组织建立在光热机械作用的基础上。在使用Er:YAG 激光时，不应忽视牙体硬组织热损伤的危险。热分析研究显示，有机成分、水分子和碳酸盐在300℃以下即可发生热改性［3］。无机和有机成分的变化可影响牙体硬组织的渗透性、溶解性或黏附性［4］。深入研究受激光影响的牙本质，特别是表面下层的结构特性，有利于指导临床口腔医生为激光处理后的牙本质选择合适的粘接方法，进而提高修复效率。大部分传统评估热损伤的方法，如组织学和扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM），属于破坏性的检测，需进行样品脱钙、脱水、切片等，处理步骤繁琐且需消耗大量的样本以及成本［5-6］，不能直接应用于临床病例。因此有必要开发一种能够实时和无创评估牙本质特征的监测工具。

光学相干层析成像（optical coherence tomography，OCT）是一种实时、无创、高分辨率的光学成像手段。其信号对比度源于生物组织或材料光学反射（散射）特性的空间变化，可以快速形成包含样本断面结构的二维或三维影像［7-10］。在牙科领域中，OCT 已被应用于隐匿龋、牙齿-充填体复合界面完整性和牙齿裂纹等的检测［11-13］。在组织结构一致的前提下，OCT 图像呈现出相同的灰度值。样品对光的折射率随着组织结构变化而变化，OCT 图像随之显示出不同的灰度值，从而揭示出不同的生物学特性［14］。基于这一理论，本研究应用OCT分析短脉冲Er:YAG 激光照射后牙本质的结构变化情况，并与组织学进行比较。

1 材料与方法

1.1 试验设备

铒-钕双波长激光器（Fotona，斯洛文尼亚，美国）；正置显微镜（DM4，Leica，Wetzlar，德国）；SEM（S-3 400N II，Hitachii，日本）；X射线能量色散谱（energy dispersive X-ray，能量色散X 射线光谱仪（energy dispersive X-ray spectroscopy，EDX），550i，IXRF Sytems，Austin TX，美国）。

1.2 处理样本

本试验样品为因阻生拔除的完整的人类第三磨牙，离体牙纳入的标准为无龋坏、无氟斑、无釉质发育不全和非四环素牙。拔牙后用手工洁治器刮除牙体上的软组织和色素，置于1%氯胺T 溶液4℃中保存。使用高速涡轮机金刚砂车针在水喷雾下去除冠部釉质层，暴露中层牙本质，用320、800、1 200、2 500 目砂纸在流水下抛光60 s，在30 倍体视显微镜下观察，确保无釉质残留；弃去表层有裂纹的牙块，从釉牙骨质界下2 mm 处切断牙根，去除牙髓，超声波振荡清洗20 min，得到牙本质圆盘，置于0.9%生理盐水中室温下保存，1 周内用于试验。本项目已通过广州医科大学附属口腔医院医学研究伦理会审查（伦理审批编号：KY2019002）。

1.3 试验分组

将牙本质圆盘随机分为6 组，每组10 个样本，分组如下：1）砂纸组 经1.2 方法处理后的牙本质圆盘即为砂纸组。2）球钻组 高速涡轮机上金刚砂球钻在水冷却下切削牙本质表面。每5 次预备后更换新的球钻。3）Er:YAG 激光组 试验光源为Er:YAG激光，脉冲频率为0～50 Hz（可调），激光光束通过关节臂传输后经透镜直接聚焦于组织样品上，光斑直径为1.3 mm。激光消融参数：能量为100 mJ，频率为20 Hz，脉冲宽度为50 μs。在连续水喷雾下，在距靶点1.0 mm 的非直接接触模式下用R14 型手持设备进行激光传输，移动激光手具切削牙本质表面。4）砂纸+酸蚀组 将样品吹干，去除多余的水分，37%磷酸蚀刻30 s，水雾冲洗30 s。5）球钻+酸蚀组 按球钻组中的方法处理牙本质表面后，37%磷酸蚀刻30 s，水雾冲洗30 s。6）激光+酸蚀组 按Er:YAG 激光组中的方法处理牙本质表面后，37%磷酸蚀刻30 s，水雾冲洗30 s。

样品表面处理完毕后，每组随机抽取样件分别进行后续检测。

1.4 光学相干层析成像技术检测

牙本质表面处理完成后，通过OCT 系统获取处理后牙本质表面的截面图。试验所用的OCT系统的中心波长λ0=840 nm，带宽Δλ=40 nm，功率P=5 mW，横向和轴向分辨率约为7.24 μm。图1 为本研究使用的定制的谱域光学相干层析成像（spectral-domain optical coherence tomography，SD-OCT）系统。

1.5 牙本质病理切片制备及苏木精-伊红化学染色

将OCT 检测后的牙本质样本浸入4%多聚甲醛中固定48 h，流水下冲洗过夜；经乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脱钙液浸泡21 d，流水下冲洗4 h 后脱水，并用石蜡包埋。每个石蜡包埋标本均切成4 μm 连续切片。将切片烘干后，用二甲苯脱蜡、加入梯度乙醇直至水化，再用蒸馏水清洗，然后进行苏木精-伊红（hematoxylineosin，H&E）染色，中性树脂封片。将切片正置显微镜下观察并拍摄照片。

1.6 SEM 及X 射线能量色散谱检测

图1 本研究中使用的SD-OCT成像系统（a）和牙本质盘（b）Fig. 1 SD-OCT imaging system (a) used in this study and the photograph of a dentin plate (b)

样品经常规固定、干燥、喷金，用SEM 分析牙本质组织微结构变化，放大倍数为1 000、3 000，加速电压为15 kV。用安装在SEM 上的EDX 检测消融牙本质元素的组成，每个样本随机选取3～4 个激光照射区域和正常牙本质组织区域，测定钙（Ca）、磷（P）元素的含量（单位：atomic percentage，at %），并计算钙磷比例。

1.7 统计学分析

本研究的试验数据采用One-Way ANOVA 分析及Kruskal-Wallis 检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

在OCT 图像上，所有试验组牙本质表层光散射特性均发生改变，可见高亮层形成，光强度随着深度的加深而减弱，牙本质表层及下层组织呈现出不同的灰度值（图2），表层组织具有较浅的灰度（较高的散射强度），下层组织的灰度值较暗（较低的散射强度），表明牙本质表层与下层组织的结构特性发生了改变。组织学结果表明：激光组牙本质表层有不规则边界的连续薄变化层（被苏木精深染，嗜碱性），没有明确的结构；球钻组牙本质表面可观察到不连续的薄变化层；经砂纸处理的牙本质表面光滑，染色最浅。H&E 染色观察到的薄染色层与OCT表面的高亮层结果一致。

定量结果（图3、4）显示，受Er:YAG 激光影响的牙本质改性层厚度明显高于砂纸和球钻组（P＜0.05），表明Er:YAG 激光诱导的牙本质变性程度强于其他两组。在空气和组织折射率不同的基础上，OCT 测量的组织厚度大于其实际值，但两者间存在显著的正线性相关性［14］。经过一系列的数学转换，可以计算得出牙本质修饰层的真实厚度。

图2 牙本质组织的OCT 图像（左）和相应的组织学图像（右）Fig. 2 The OCT images (left) and the corresponding histological images (right) of dentin tissue

图3 OCT强度分布图Fig. 3 The OCT intensity profile

基于Er:YAG 激光切削硬组织的光热及光蚀理论，Er:YAG 激光切削可能导致牙本质化学结构的变化［15］，从而导致OCT 图像中高亮层的出现。关于受激光影响的牙本质深度，霍晓等［6］和Ceballos等［15］通过投射电镜（transmission electron microscope，TEM）分析发现Er:YAG 激光照射后牙本质表面形成了3～5 μm 厚的修饰层。在光学显微镜研究中，Almehdi 等［16］观察到激光处理后牙骨质表面形成了深染的嗜碱性层，而在球钻处理后的组织表面未见深染的嗜碱或嗜酸性层。该作者推测表面变性层是由激光热效应引起的。据报道，选择适当的Er:YAG 激光参数有助于降低牙本质组分的热效应。与传统评估牙本质表面下层性质的方法相比，OCT具有非电离、无创、实时、重复性好等优点［5-6］。由此可见，OCT 技术可辅助临床医生选择合适的Er:YAG 激光参数，减少临床中不必要的热损伤。然而，值得注意的是，通过OCT 图像无法解释不同灰度层相对应的组织结构［5］。为了进一步研究受影响层的耐酸性能，指导临床磷酸蚀刻时间，本研究接下来进行了SEM 和EDX 光谱分析。

SEM 结果（图5）显示：激光组的牙本质表面呈鳞片状不规则形态，无玷污层，牙本质小管开放，呈袖口状突出；磷酸处理后，牙本质小管开口扩大，未见明显的胶原纤维网暴露；砂纸组及球钻组的牙本质表面可见玷污层覆盖，牙本质小管封闭；磷酸处理后，牙本质表面无玷污层，牙本质小管呈漏斗状开放，胶原纤维网暴露。

EDX 结果（表1）显示：激光+酸蚀组的钙含量、磷含量在所有酸处理组中最高（P＜0.05），这表明激光处理后的牙本质变得更耐酸；砂纸组及球钻组间钙、磷含量均无统计学差异（P＞0.05）。所有试验组间钙磷比例无统计学差异（P＞0.05），表明牙本质的羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）晶体未发生变性或重建。

图4 OCT 图像上的牙本质高亮层的厚度结果Fig. 4 The thickness of the layer with high image intensity generated on the dentin in the OCT analysis

由于HA 晶体中钙和磷原子的比例是相对恒定的［4］，根据Ca/P 的比值可推测HA 的晶体结构。据文献报道，Er:YAG 激光能量密度低于7 J/cm2时，牙齿表面最高温升约有300℃［17］。在本研究中，激光输出能量剂量（1.88 J/cm2）较低，硬组织的表面温升小于300℃，这可以解释牙本质HA 晶体为何未发生变性和重建。有文献报道，激光改性牙本质的变化主要包括碳酸盐含量的降低和结晶度的提高，这可能会增加辐照底物对酸的耐受性［18］。He 等［19］同样观察到，当每单脉冲100 mJ 的Er:YAG 激光照射牙本质后，牙本质的耐酸性增加。本研究的结果与He 等先前报道的研究结果一致。

3 讨论

牙本质由有机组分和无机组分组成，其中无机组分主要是HA 晶体中的钙和磷。激光照射后生物组织的化学改变很大程度上取决于其成分的性质。SEM 结果表明，Er:YAG 激光组与球钻组间钙、磷含量及钙磷比例无统计学差异，但磷酸处理同样时间后，球钻组钙、磷含量显著低于激光组，这说明激光组的牙本质表面变得更耐酸。Esteves-Oliveira 等［20］发现，Er:YAG 激光处理后牙本质碳磷比降低，表面变得更稳定、更耐酸。Ramos 等［21］发现Er:YAG 激光处理后牙本质胶原纤维变性融合，间隙缩小，这影响了磷酸接触牙本质，阻碍了粘接剂渗透至脱矿全层，导致全酸蚀粘接组粘接强度低于自酸蚀组。

图5 牙本质表面的SEM图Fig. 5 SEM of treated dentin surfaces

表1 酸处理前后牙本质表面元素的平均值±标准差（原子百分比，at%）Tab. 1 ±s of dentin surface elements before and after acid treatment (atomic percentage, at%)

表1 酸处理前后牙本质表面元素的平均值±标准差（原子百分比，at%）Tab. 1 ±s of dentin surface elements before and after acid treatment (atomic percentage, at%)

注：不同小写字母表示不同组间的结果具有统计学差异（P＜0.05）。Note: Different lowercase letters indicate significant differences in the results among different groups (P＜0.05).

Elements Sandpaper-treated group Er:YAG laser plus acid treated group Ca 19.22±2.91 a 20.01±2.90 a 18.97±2.96 a 7.07±1.30 b 7.58±1.18 b 14.67±1.93 c P 16.32±2.37 a 16.80±2.71 a 16.31±1.88 a 6.33±1.04 b 6.87±1.03 b 12.66±1.32 c Ca/P 1.20±0.11 a 1.19±0.11 a 1.18±0.11 a 1.12±0.08 a 1.11±0.06 a 1.16±0.10 a Bur-treated group Er:YAG laser-treated group Sandpaper plus acid treated group Bur plus acid treated group

轴向分辨率和成像深度是决定厚度测量准确性的关键参数。本研究所用的OCT 系统的轴向分辨率约为10 μm，对牙本质的成像深度超过250 μm，病理切片显示深染层的厚度范围是30～50 μm，因此本研究的OCT 系统可以准确测量Er:YAG 激光消融牙本质后表面变性层的厚度。OCT 结果显示，所有试验组牙本质表层光散射特性均发生改变，可见高亮层形成，光强度随着深度的加深而减弱。定量结果表明，受Er:YAG 激光影响的牙本质层厚度明显高于球钻组和砂纸组，说明Er:YAG 激光导致的牙本质变性作用强于球钻切削及砂纸抛光。OCT 图像中不同的灰度值被认为是由于光从空气传到组织时折射率的差异造成的［13］。Er:YAG 激光的光热机械消融作用可能使牙本质结构发生改变，从而导致OCT 图像上不同厚度的改性层出现。组织学结果显示，激光组牙本质表层有不规则边界的连续嗜碱性薄变化层，而球钻组未见牙本质表层或形成不连续的薄变化层，改性层结果与OCT 光强变化结果一致。同样，Ishizaka 等［22］通过H&E 染色发现，激光处理的牙本质表面有一层嗜碱性深染层，而球钻处理后牙本质表面未见深染层。与组织学相比，OCT 技术可实时无损地定量表征牙本质表层性状的改变，两种方法得到的改性层厚度有一定的相关性和一致性。

总之，本研究结果表明，使用OCT 技术可实时无损地定量表征牙本质表层性状的改变，其效果相当于传统的组织病理切片。经过一系列的数学转换可得到牙本质修饰层的厚度。尽管激光处理后的牙本质的HA 晶体结构未发生改变，但激光处理后的牙本质变得更耐酸。从临床的角度来看，这些信息将有助于牙医确定粘接修复策略。在今后的研究中，应深入研究激光对牙齿表层的结构损伤及牙体硬组织性质的影响，以确定牙本质粘接修复的最佳方法。