五味子甲素协同吉西他滨调控β-catenin通路抑制胰腺癌细胞增殖的研究

聂佳佳

(上海市第八人民医院消化内科，上海 200233)

胰腺癌是恶性程度极高的消化系统恶性肿瘤，患者预后极差，5年生存率低下。吉西他滨是用于胰腺癌治疗的一线化疗药物，但单药治疗的临床获益有限，联合顺铂、5-氟尿嘧啶等其他化疗药物或厄洛替尼等靶向药物的不良反应大,且尚无足够证据表明联合用药能获得更理想的生存获益[1-2]。五味子甲素是中药五味子中的一类木质素化合物，多项胰腺癌相关的细胞实验[3-4]表明，五味子甲素能够抑制细胞的增殖、迁移和侵袭，表明五味子甲素可能具有抗胰腺癌的潜在作用过于绝对。有实验[5]表明，五味子甲素能够协同吉西他滨抑制肝癌细胞增殖，同时抑制β-连环蛋白(β-catenin)通路的激活。但五味子甲素与吉西他滨联用是否能够协同抑制胰腺癌细胞的增殖、以及是否抑制β-catenin通路的激活均尚不明确。为此，本实验将以胰腺癌PANC-1细胞株为实验对象，具体分析五味子甲素协同吉西他滨调控β-catenin通路抑制胰腺癌细胞增殖的作用。

1 材料与方法

1.1材料 胰腺癌PANC-1细胞株购自ATCC公司，五味子甲素购自MCE公司，MTS法细胞活力检测试剂盒购自Promega公司，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)购自Sigma公司，RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒北京索莱宝公司，B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated x protein，Bax)、细胞周期素D1(cyclinD1)、β-连环蛋白(β-catenin)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(Phosphorylation Glycogen synthase kinase3β，p-GSK-3β)购自Abcam公司。

1.2方法 PANC-1细胞在含有10%胎牛血清的完全培养液中贴壁培养，每2 d更换1次完全培养液，待细胞融合至80%后用0.25%胰蛋白酶进行消化并传代。传代后的细胞接种在培养板内进行分组给药，对照组用不含药物的培养基处理；吉西他滨组用含有50 μg/mL吉西他滨的培养基处理；五味子甲素组用含有25 μmol/L五味子甲素的培养基处理；吉西他滨+五味子甲素组用含有50 μg/mL吉西他滨及25 μmol/L五味子甲素的培养基处理。将PANC-1细胞接种在96孔培养板中，分组给药后24，36，48 h时，采用MTS法细胞活力检测试剂盒进行实验，向每个培养孔内加入20 μL检测液并在培养箱内继续培养4 h，而后取出培养板、在酶标仪上检测490 nm波长的吸光值A490。将PANC-1细胞接种在6孔培养板中，分组给药后48 h时，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，80%冷甲醇-20℃固定过夜；次日，离心收集细胞并调整密度至1×107/mL，取100 μL细胞悬液、加入400 μL PI染液，避光孵育30 min，最后在流式细胞仪上检测细胞周期。将PANC-1细胞接种在12孔培养板内，分组给药后48 h时，弃培养基、保留细胞，用RIPA裂解液裂解细胞并提取蛋白样本，用BCA法试剂盒测定样本中的蛋白含量，根据测定结果取含有20 μg蛋白的样本进行Western blot检测。电泳后电转移至NC膜，封闭1 h后孵育Bcl-2、Bax、cyclinD1、β-catenin、p-GSK-3β、β-actin一抗4过夜，次日孵育二抗1 h，最后将NC膜放入凝胶成像系统进行显影，得到蛋白条带简述，根据条带的灰度值计算表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0软件录入数据，四组间计量资料的比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1PANC-1细胞活力的比较 药物干预24，36，48 h后，与对照组比较，吉西他滨组、五味子甲素、吉西他滨+五味子甲素组的A490水平均明显降低(P<0.05)且吉西他滨+五味子甲素组的A490水平均明显低于吉西他滨组、五味子甲素组(P<0.05)；吉西他滨组、五味子甲素组、吉西他滨+五味子甲素组内干预24，36，48 h时A490的两两比较均有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 四组PANC-1细胞活力的比较

2.2PANC-1细胞周期的比较 药物干预48 h后，与对照组比较，吉西他滨组、五味子甲素、吉西他滨+五味子甲素组G0/G1期比例明显增加，S期、G2/M期比例明显降低(P<0.05)且吉西他滨+五味子甲素组G0/G1期比例明显高于吉西他滨组、五味子甲素组，S期、G2/M期比例明显低于吉西他滨组、五味子甲素组(P<0.05)。见表2。

表2 四组PANC-1细胞周期的比较

2.3PANC-1细胞中增殖及细胞周期相关基因表达的比较 药物干预48 h后，与对照组比较，吉西他滨组、五味子甲素、吉西他滨+五味子甲素组Bcl-2、cyclinD1的表达水平明显降低，Bax的表达水平明显增加(P<0.05)且吉西他滨+五味子甲素组Bcl-2、cyclinD1的表达水平明显低于吉西他滨组、五味子甲素组，Bax的表达水平明显高于吉西他滨组、五味子甲素组(P<0.05)。见图1，表3。

图1 四组PANC-1细胞中Bcl-2、Bax、cyclinD1的蛋白条带

表3 四组PANC-1细胞中Bcl-2、Bax、cyclinD1表达的比较

2.4PANC-1细胞中β-catenin表达的比较 药物干预48 h后，与对照组比较，吉西他滨组、五味子甲素、吉西他滨+五味子甲素组β-catenin、p-GSK-3β的表达水平明显降低(P<0.05)且吉西他滨+五味子甲素组β-catenin、p-GSK-3β的表达水平明显低于吉西他滨组、五味子甲素组(P<0.05)。见图2，表4。

图2 四组PANC-1细胞中β-catenin、p-GSK-3β的蛋白条带

表4 四组PANC-1细胞中β-catenin、p-GSK-3β表达的比较

3 讨 论

五味子甲素是一种具有抗癌活性的木质素类化合物，提取自中药五味子，对胰腺癌、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌等恶性肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭具有抑制作用[6-8]，也有研究[9]报道能够诱导胶质瘤细胞的细胞周期发生停滞。本实验在使用五味子甲素处理胰腺癌PANC-1细胞后观察到,细胞活力A490水平及细胞周期S期、G2/M期比例均降低，G0/G1期比例增加，表明五味子甲素能够抑制胰腺癌细胞的增殖及细胞周期的进程，与既往关于五味子甲素具有抑癌活性的研究结果一致。本实验采用五味子甲素联合吉西他滨处理胰腺癌细胞后观察到，细胞活力A490水平及细胞周期S期、G2/M期比例的降低及G0/G1期比例的增加均较单用五味子甲素或单用吉西他滨更显著。表明五味子甲素能够协同吉西他滨抑制胰腺癌的增殖，五味子甲素联合吉西他滨能够取得更强的抗胰腺癌作用。

有研究[3,7]显示，五味子甲素能够在胰腺癌、肺癌中抑制Bcl-2、增加Bax的表达；另有研究[8,10]显示，五味子甲素能够在甲状腺癌、卵巢癌中抑制cyclinD1的表达。Bcl-2和Bax是调控线粒体对细胞色素C通透性的分子，前者抑制细胞色素C释放、后者促进细胞色素C释放，细胞色素C释放后促进细胞凋亡、抑制细胞增殖[11]；cyclinD1参与细胞周期调控，能够促进细胞快速通过细胞周期的检查点并进行有丝分裂[12]。本实验在用五味子甲素干预胰腺癌细胞后观察到：Bcl-2、cyclinD1表达减少，Bax表达增加，与既往其他研究关于五味子甲素调控基因表达的结果一致；在五味子甲素联合吉西他滨干预后，Bcl-2、cyclinD1表达减少及Bax表达增加均较单用五味子甲素或单用吉西他滨更显著，表明五味子甲素能够协同吉西他滨调节胰腺癌细胞中增殖及细胞周期相关基因的表达，与其协同抑制细胞增殖及细胞周期的作用吻合。

本实验还对五味子甲素发挥上述协同作用的分子机制进行了初步探究。本实验在用五味子甲素及吉西他滨处理胰腺癌细胞后观察到：细胞中β-catenin、p-GSK-3β的表达均明显降低且五味子甲素联合吉西他滨干预后，β-catenin、p-GSK-3β表达减少较单用五味子甲素或单用吉西他滨更显著，表明五味子甲素能够协同吉西他滨抑制胰腺癌细胞中β-catenin通路的激活，这可能是其协同发挥抗胰腺癌作用的分子机制。

综上所述，五味子甲素具有协同吉西他滨抑制胰腺癌细胞增殖的作用，该作用与靶向抑制β-catenin通路有关，但β-catenin通路在五味子甲素联合吉西他滨抗胰腺癌中的直接作用仍有待今后更多的研究来证实。