miRNA-132靶向SCN2A调控对癫痫大鼠海马区细胞凋亡的影响

李顺钧 浦苏颖 王慧 李云霞

(1.上海市徐汇区大华医院神经内科，上海 200237；2.上海市同济医院神经内科，上海 200065)

癫痫发作与患者脑组织多种细胞蛋白代谢有关，会导致多种基因模式发生改变[1]。miRNA参与癫痫发展主要是通过参与神经系统中炎症发应、神经细胞凋亡、神经元坏死、树突生长、胶质细胞增生等过程，同时在癫痫网络形成，神经递质以及机体损伤过程中发挥重要作用[2]。J.Yuan等[3]研究指出，神经系统因为各种病理改变，造成海马内回返兴奋性环路形成，促进癫痫发生。SCN2A在不同类型的癫痫患者中均有SCN2A基因突变，通过SCN2A编码的神经元电压门在调控钠离子通道中发挥重要作用[4]。有研究[5]显示，靶向SCN2A基因治疗癫痫效果明显。本文旨在研究miRNA-132靶向SCN2A调控对癫痫大鼠海马区细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1动物和主要试剂 清洁级雄性SD大鼠60只，大鼠8～10周龄，平均(9.8±1.2)周龄，体重200～220 g,平均(210.4±5.2)g，由海南医学院实验动物中心提供。本文研究所做实验均获得我院伦理委员会批准。主要试剂：大鼠抗小鼠Bcl-2、Bax、Akt抗体(英国Abcam公司)。

1.2方法 30只大鼠随机分为模型组、过表达组、沉默组，各10只。使用127 mg/kg氯化锂给予腹腔麻醉，24 h后给予1 mg/kg丁溴东莨菪碱进行腹腔麻醉，30 min给予30 mg/kg 1%的匹罗卡品腹腔麻醉，按照Racine分级标准，如果无发作或者发作未达到Ⅳ级，每间隔30 min给予10 mg/kg匹罗卡品腹腔麻醉，出现癫痫持续状态即建模成功。三组大鼠海马区细胞在培养瓶中融合率在75%左右时进行转染，测量细胞密度后以每个六孔板中约4×105个细胞进行种植，加入到3 mL新鲜培养基中之后进行孵育培养(5%CO2、温度温度为37℃)的培养箱中，细胞孵育到融合率在40%～80%之间时取1.5 μL的质粒DNA溶于100 μL的双抗培养基中(不含血清)，充分混合后进行离心，在EP管中加入12 μL的PolyFect Reagent，上下重复颠倒5次进行混匀处理，于室温环境下进行静置5～10 min，吸去置于六孔板中的培养基，加入3 mL的新鲜完全培养基，在含有转染复合体的EP管中加入含有血清和双抗的600 μL完全培养基，上下重复颠倒2次后加入六孔板中进行培养，24 h后进行常规的换液处理，再次继续24 h的培养，倒置，使用荧光显微镜下对荧光亮度进行观察，对细胞进行收集，提取细胞RNA，鉴定转染效率，将转染效率最高的质粒组、空载组稀释液接种于10 mm2培养皿中(PCR验证筛选)，将40 μL嘌呤霉素加入每孔后常规培养，培养3 d后弃培养液，选取经过PCR验证筛选的细胞进行消化处理后稀释，接种在24孔板中，最终建立稳定转染的过表达组、沉默组。建模成功后处死大鼠，提取大鼠海马区组织制作标本，使用40 mL/L的多聚甲醛进行固定，常温下使用15%的EDTA脱钙，脱水后进行石蜡包埋，制作3 μm的组织切片，HE染色。TRIzol提取细胞RNA，经过电泳检测RNA并定量，经过逆转录合成cDNA。进行实时荧光定量PCR实验，探针或SYBR反应25 μL，反应条件满足：94℃ 5 min,94℃ 45 s,60℃ 1 min,40个循环,设置标准组和空白对照。将PCR反应实验前3～15个循环荧光信号作为荧光本底信号，调节基线，采用2-△△CT分析SCN2A基因表达。使用10%的胎小牛血清培养液配成单个细胞悬液，以每孔1 000～10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积为200 μL。培养24，48，72 h后，每孔加MTT溶液(5 mg/mL PBS配置)20 μL。继续孵育4 h，结束培养，弃上清液。每孔中加入150 μL DMSO，振荡10 min。选择490 nm波长，使用酶联免疫监测仪检测各孔光吸收值。将各组细胞转染质粒24 h后，将细胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化5 min至细胞瓶表面呈雾状，PBS吹打下来，4℃ 2 000 rpm 3 min，PBS洗涤、离心、重悬2次，流式细胞仪分析细胞凋亡率。常规蛋白提取，采取BCA法进行定量分析。50 μg的蛋白样品上样后SDS-PAGE电泳，通过蛋白电转到PVDF膜，使用5%的脱脂奶粉TBST中进行避光封闭1 h，洗涤之后加入一抗稀释溶液(Bcl-2、Bax、Akt按照1∶1 000比例进行稀释)，在4℃的环境中过夜保存，洗涤后加入二抗稀释溶液(Bcl-2、Bax、Akt按照1∶5 000比例进行稀释)，在温床中孵育1 h后再次洗涤，加入发光液ECL，曝光2～3次，取重叠值。使用软件分析蛋白条带灰度值，内参蛋白是GAPDH。

2 结 果

2.1病理学观察 模型组大鼠海马区细胞肿胀，部分破裂，排列紊乱(黑色箭头表示)；过表达组大鼠海马区细胞损伤明显，细胞萎缩、肿胀、破裂严重，染色质和细胞核浓缩。沉默组大鼠海马区细胞排列较整齐，细胞肿胀明显降低。见图1。

2.2SCN2A在癫痫大鼠中的表达 三组SCN2A mRNA表达分别为：模型组(1.26±0.21)、过表达组(0.56±0.15)、沉默组(1.62±0.32)。与模型组相比，过表达组SCN2A mRNA表达降低；沉默组SCN2A mRNA表达升高(P<0.05)。与过表达组相比，沉默组SCN2A mRNA表达升高(P<0.05)。三组比较差异均有统计学意义(F=14.227，P均<0.001)。

2.3海马区细胞增殖率的比较 与模型组相比，过表达组海马区细胞增殖率降低，沉默组海马区细胞增殖率升高(P<0.05)。与过表达组相比，沉默组海马区细胞增殖率升高(P<0.05)。模型组在24，48，72 h细胞增殖率逐渐升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，过表达组逐渐降低，沉默组逐渐升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点海马区细胞增殖率比较

2.4海马区细胞凋亡率的比较 与模型组相比，过表达组海马区细胞凋亡率升高，沉默组海马区细胞凋亡率降低(P<0.05)。与过表达组相比，沉默组海马区细胞细胞凋亡率降低(P<0.05)。模型组在24，48，72 h细胞凋亡率逐渐升高，但差异无统计学意义(P>0.05)，过表达组逐渐升高，沉默组逐渐降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠不同时间点海马区细胞凋亡率比较

2.5Western blot检测 与模型组相比，过表达组Bcl-2表达升高，Akt、Bax蛋白表达降低，沉默组Bcl-2蛋白表达降低，Akt、Bax表达升高(Akt、Bax表达升高不甚明显)，具有统计学差异(P<0.05)。与过表达组相比，沉默组Bcl-2蛋白表达降低，Akt、Bax表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

3 讨 论

miRNA属于一种短非编码调控RNA，在调控基因表达方面效果显著。且可作为诊断癫痫潜在的生物标记因子[6-7]。miR-132属于一种活性依赖RNA，在神经元具有高度保守性并且相关含量较为丰富。癫痫的发生主要与多种编码电压门控性钠离子通道基因突变有关，其中主要集中在编码钠离子通道α亚基SCN1A、SCN2A和编码β亚基的基因 SCN1B中发现[8]。SCN2A的基因突变与全面性癫痫伴热性惊厥附加症、良性家族性新生儿-婴儿惊厥、儿童难治性癫痫有关[9]。L.Xia等[10]指出，miR-132表达水平与癫痫的发作有关。本研究结果显示，沉默组与过表达组和模型组相比，SCN2A mRNA表达升高，说明沉默miR-132，能够上调SCN2A mRNA表达。在体外细胞研究中显示，抑制miR-132-3p，细胞中的SCN2A表达升高，证实miR-132-3p与SCN2A之间具有抑制关系。本研究结果显示，沉默组在24，48，72 h细胞增殖率逐渐升高，并且与过表达组和模型组相比，各时间段海马区细胞增殖率升高。说明沉默miR-132能够促进海马区细胞增殖。研究[11]指出，miR-132是一种抑癌基因,通过靶向调控相关因子对癌细胞增殖和凋亡起到抑制作用。本研究显示，采用流式细胞仪检测细胞凋亡，发现沉默组在24，48，72 h细胞凋亡率逐渐降低，与过表达组和模型组相比，其各时间段海马区细胞凋亡率降低。说明沉默miR-132能够抑制海马区细胞凋亡。

miR-132诱发癫痫的途径是通过影响影响突触的结构和功能。Bcl-2属于一种常见的抑癌蛋白，Bax属于一种凋亡诱导基因，两者结合以二聚体的形式存在，在细胞增殖和凋亡过程中发挥重要重要作用。A.Skardoutsou等[12]指出，Bcl-2与Bax基因结合产生二聚体，促进细胞凋亡。Akt是PI3K下游的靶蛋白，激活Akt能够促进细胞生长，发挥抗凋亡作用。本研究结果显示，沉默组与过表达组和模型组相比，Bcl-2蛋白表达降低，Akt、Bax表达升高。说明miRNA-132沉默通过抑制Bcl-2表达，促进Akt、Bax升高，从而抑制癫痫大鼠海马区细胞增殖，抑制其凋亡。

综上所述，miRNA-132沉默能够增强SCN2A表达，miRNA-132通过靶向调控SCN2A，能促进癫痫大鼠海马区细胞增殖，抑制其凋亡。为miRNA-132在癫痫中的临床诊断和治疗提供理论依据。(本文图1,图2见封三)