复合有机底物化学振荡体系的中药非线性电化学指纹图谱研究

杜宝中，荆媛媛，冯祖飞，樊 花，刘广钧

(西安理工大学应用化学系，陕西西安，710048)

中医药历经数千年的传承与发展，在世界四大传统医药体系中确立了自身独特的理论体系，且临床疗效显著。迄今，已有近百个国家将中医药用于临床，且全球超过80%的人使用天然植物药。然而，在国际中药市场，我国仅占不足10%的份额，并以原料药输出为主[1]。究其原因，主要是目前对中药的特质、药性及质量控制与评价等手段多依赖于经验，特别是对中药的群集信息、道地性、复方等的定性定量分析缺乏科学、简便和有效的检测方法与手段，导致市场出现以劣充优、以假乱真等现象，严重制约了中药现代化的进程。因此，开发和建立中药安全使用、质量保障及科学鉴别的技术，已经成为中药现代化进程中亟待解决的重要课题。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

CHI660b电化学工作站(上海辰华仪器公司)；JJ-1型电动搅拌器(常州国华电器有限公司)；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；SB224 S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；217型双液接饱和甘汞电极(上海精密科学仪器有限公司)；902C型铂电极(江苏江分电分析仪器有限公司)。

KBrO3、Ce(SO4)2·4H2O、H2SO4、丙二酸、苹果酸。试剂均为分析纯，水为去离子水。

当归(陕西)、川穹(四川)、三棱(黑龙江)、土茯苓(安徽)、川贝(陕西)、丹参(陕西)、金银花(湖南、陕西、河南)、金钱草(四川)、秦皮(陕西)、石膏(陕西)等，均为市售并经陕西省食品药品监督检验研究院中药室主任罗定强高级工程师鉴定。

1.2 检测方法

控制水浴温度为37±1 ℃，溶液总体积50 mL。向100 mL反应器中依次加入1.00 g干燥的中药粉末(粒径<0.15 mm)，H2SO4浸泡20 min，再每隔4 min依次加入丙二酸、苹果酸、Ce(SO4)2，启动搅拌，插入指示电极和参比电极，加入5 mL KBrO3溶液，记录E-t曲线至电位振荡消失。即可获得中药非线性电化学指纹图谱。

2 结果与讨论

2.1 振荡图谱

2.2 空白体系的稳定性

中药电化学指纹图谱是基于空白化学振荡体系，以中药化学成分对振荡反应机理产生影响(抑制或促进)而形成的特征图谱，所以建立稳定的空白体系是获取可重现的指纹图谱的关键。为此，将振荡体系的各组分通过单因素实验，考察图谱的诱导期(t0)、振荡期(td)、最大振幅(Amax)、振荡周期(T)、最高电位(Emax)、最低电位(Emin)、平衡电位(Ea)7个参数(表1和图1)。平行测定3次，相对标准偏差(RSD)≤1.58%。因此空白振荡体系具有良好的重现性和稳定性。

表1 空白体系电化学指纹图谱稳定性和重现性

2.3 体系组成与测试条件

实验发现，丹参加入量与t0和T线性相关，如图3所示。此为中药群集信息的定量分析和质量评价提供了理论依据。

2.4 图谱重现性

中药指纹图谱的特征之一，即重现性，也是其是否具有通用性和实用价值的衡量标准。为此，实验考察了丹参电化学指纹图谱的重现性，结果见表2。由表2可知，RSD≤1.51%，表明中药在该振荡体系中形成的非线性电化学指纹图谱重现性良好。

图1 空白体系电化学指纹图谱Fig.1 Electrochemical fingerprint of blank system

图2 丹参的电化学指纹图谱Fig.2 Electrochemical fingerprint of Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma

图3 中药加入量与诱导期和振荡周期的线性关系Fig.3 Linear relationship between the dosage of traditional Chinese Medicine and induction period and oscillation period

表2 丹参电化学指纹图谱的重现性

2.5 图谱特异性

化学振荡体系对外来化学物质十分敏感，诸如微量元素、生物碱、有机酸、氨基酸、多酞、维生素、酶、酮类、羟基和醚类等化合物，对振荡图谱(E-t曲线)的参数产生较大程度的影响；而不同中药往往含有上述不同的微量或宏量化学物质，对诱导和振荡反应产生的干扰或与振荡体系中各反应物或中间体发生的作用不同，引起诱导和振荡反应各种特征信息的变化不同，从而导致部分参数乃至整个振荡图谱形状的改变。而化学振荡反应是以有机物为振荡底物，当振荡器中各组分确定，只改变有机底物(中药)的种类时，所获振荡波形即为该物质(中药)的特征图谱。

2.6 道地中药材鉴别

道地中药材系指质优效佳的中药，为特定自然条件和生态环境的区域内所产的药材，是一项辨别优质中药材质量的独具特色的综合判别标准。即同种中药因地域差异而对其药效产生显著影响，致使市场出现“以次充优”的现象，所以亟待建立科学、有效的鉴定方法。本法检测了不同产地的枸杞和金银花，同类中药其图谱的形状基本相似，说明所含化学成分相同或相似，但特征参数有显著差异(如td、T、Amax)，这与其化学成分的含量不同有关(如多糖、绿原酸)。表明电化学指纹图谱技术可用于中药材道地性的质量评价，不同地域中药的电化学指纹图谱见图5。

图4 不同中药的电化学指纹图谱Fig.4 Electrochemical fingerprint of different Chinese Medicines

图5 不同地域中药的电化学指纹图谱Fig.5 Electrochemical fingerprint of traditional Chinese Medicine in different regions

2.7 不同部位中药的指纹图谱

众所周知，同一中药的不同部位在药用上有着较大差异，或为全株入药，或是根、茎等，由于各个部位作用趋向不同还需区别使用。如全当归具有补血活血、通经活络之功效，而当归尾偏於活血和破血，当归身偏於补血和养血；如何进行有效识别一直是困扰人们的难题。本文分别检测了全当归、当归尾和当归身的图谱(图6)。三者图谱外形相似，说明所含的化学成分相似。但t0和Amax却有明显差异，应是化学成分及其含量存有差异所致。表明该法可用于中药不同部位的识别与评价。

2.8 不同形态中药的区别

中药临床应用有多种剂型，如水剂、膏剂、丸剂、散剂等，而最常用的是水剂。实验模拟中药熬制，分别取当归汁的上清液、药渣及当归粉进行检测。将二者与当归粉的电化学指纹图谱对比发现(图7)，水剂图谱的t0很短，td较长，Amax较大，即汤汁中的化学成分溶出充分、含量高。所以，中药宜水煎服用。

图6 当归不同部位电化学指纹图谱Fig.6 Electrochemical fingerprint of Angelica sinensis radix’s different parts

图7 当归不同形态的电化学指纹图谱Fig.7 Electrochemical fingerprint of Angelica sinensis radix in different dosage forms

2.9 复方中药指纹图谱

中药的药效多体现在复方配伍，所谓“相生相克”。为此，探讨了复方与单味中药指纹图谱的特征性。当归可补血、活血、调经止痛、润燥滑肠；川穹性温，有活血顺气的作用，二者配伍用于活血止痛，调经理气。黄芪性温味甘，有补气固表、利尿生肌，而土茯苓可解毒除湿、利关节；二者配伍能起到健脾、益气、祛湿的功效。复方中药的指纹图谱如图8所示。

图8 复方中药电化学指纹图谱Fig.8 Compound mixed electrochemical fingerprint

图9 不同添加物对丹参电化学指纹图谱的影响Fig.9 Effect of different additives on the electrochemical fingerprint of Salvia miltiorrhiza

复方中药指纹图谱兼具单味中药图谱的特征，有相似性，但存在明显差异，其t0明显缩短、td延长,T、E介于二者之间，Amax增大，这应为相生配伍致使振荡反应(药效)加快及对体系的扰动(促进)作用增强。表明本法可对中药复方配伍后各组分间协同效应的评价提供科学依据。

2.10 添加物对中药指纹图谱的影响

考察了不同添加物对中药指纹图谱的影响。取丹参与添加物的质量比为1∶1，振荡反应至700 s，分别加入乙醇、咖啡及绿豆粉。结果如图9所示。

由于丙二酸和苹果酸可与乙醇发生酯化反应，从而阻止自催化反应的进行，咖啡的主要成分是咖啡因和鞣酸，鞣酸与药物中的蛋白质、生物碱或重金属盐等起化学作用而产生沉淀，绿豆中特有的蛋白会与中药的一些成分发生反应；以上均直接或间接的阻碍了中药参与振荡反应，致使体系振荡减弱甚至停振。表明服药期应忌饮酒和咖啡等，以保证其药效。

2.11 单有机与复合有机底物的比较

实验测定了丹参在单有机和复合有机底物振荡体系中的非线性电化学指纹图谱(图10)。解析图10可知，复合有机底物振荡图谱并非两个单有机底物振荡图谱的线性叠加，与单有机底物相比较，复合有机底物体系的t0较短、td适中、Amax较大，T小，因而信息丰富、特异性强。这是由于丙二酸消除反应过程中过量的Br2，而苹果酸不仅可以加快Br2的转化和消耗，使Br-再生，还能将Ce4+还原成Ce3+。显然，复合有机物之间的协同作用更大程度地提高了反应的可逆性和检测的灵敏度，同时也为构建振荡体系对有机底物的选择上提供了新的思路。

图10 单有机和复合有机底物体系的丹参电化学指纹图谱Fig.10 Electrochemical fingerprint of Salvia miltiorrhiza in mono-organic and compound organic substrate systems

3 振荡反应机理

化学振荡体系对温度十分敏感，温度升高，反应速率加快，诱导期和振荡周期明显缩短。分别将ln(1/t0)和ln(1/td)对1/T直线拟合，均呈良好的线性关系，与Arrhenius公式相比较，求得诱导期和振荡期的表观活化能分别为25.7 kJ/moL和72.1 kJ/moL，表明二者反应机理不同。即振荡反应包含诱导期和振荡期两个过程，诱导期为振荡反应积蓄能量(电势)，以使体系能够发生振荡反应，二者为因果关系。若以中药为反应底物，则振荡反应历程为[11,12]：

(1)诱导反应

(1)

(2)

(3)

(4)

(2)振荡反应

(5)

(6)

(7)

诱导期积累Br-和Ce3+，反应生成的Br2通过丙二酸和苹果酸除去。振荡期Br-在(5)被消耗、(7)再生；由此推测c(Br-)在振荡期呈现先减小再增大的循环振荡过程，应为化学振荡反应的成因。

实验以Br-离子选择性电极动态监测空白体系和加药体系中cBr-的变化(图11和图12)。由图可知，在化学振荡反应中，Br-电极响应电位随时间呈周期性变化，验证了机理推导的合理性。

图11 空白振荡体系Br-浓度变化循环图Fig.11 The change of Br- concentration in blank oscillating system

图12 加药振荡体系Br-浓度变化循环图Fig.12 The change of Br- concentration in medicine adding oscillation system

另外，在空白体系的循环伏安图中，Br2的还原峰为0.484 V(vs.SCE，下同)，Br-和Ce3+的氧化峰分别为0.902 V和1.184 V；当体系加入中药后，其化学成分抑制了Ce4+/Ce3+参与化学反应，1.184 V处的氧化峰消失，同时Br-的氧化峰移至0.782 V，Br2还原峰移至0.449 V，且还原峰电流增大，氧化峰电流减小。结果表明，随着中药(板蓝根)量的增加，Br-的氧化峰电流逐渐减小，且在0.5～1.0 g之间呈良好的线性关系(y=-0.3587x+0.4264，R2=0.9903)。佐证了“2.3”提出的用于中药和中成药群集化学成分定量分析的可靠性。

4 结论