猪肉中常见的9种蓄水类药物残留的快速筛查

陈树兵，余晓玲，李 双，方科益，余晓琴，韩 超，王传现

(1.宁波海关技术中心，浙江宁波 315040；2.四川省食品药品检验检测院，四川成都，610097；3.浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015；4.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135)

我国作为猪肉消费大国，其肉制品的生产安全直接关系到民生建设。近些年，出现的“注水肉”问题与非法使用新型蓄水类药物直接相关。新型蓄水类药物主要包括：阻断M胆碱受体的抗胆碱药物(阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱)，局部麻醉药物(普鲁卡因、利多卡因)，抗组胺类药物(异丙嗪)和肾上腺素受体激动药物(肾上腺素及其代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸)[1 - 10]。这些药物的非法使用将不可避免地残留于猪肉食品中,进而对人体中枢神经造成不良影响。目前，我国蓄水类药物残留检测标准缺乏，已有文献多是按照某一类药物建立的，适应范围单一[1,2,8,11,12]，尚无同时测定猪肉中9种蓄水类药物及其代谢物的报道。因此，建立猪肉中蓄水类药物的高通量筛查方法，对于提高监管工作效率、保障猪肉食品安全具有重要的意义。

蓄水类药物检测主要涉及前处理技术和仪器分析两方面。已有方法主要采用固相萃取柱净化。例如：王海燕等[1]对畜肉中阿托品类药物残留量测定，前处理采用MCX小柱净化；胡海山等[8]对动物源性食品中镇静剂类药物残留量测定，乙腈提取后经Oasis HLB小柱净化；另外，段科等[5]对肉中的阿托品类药物残留量测定，乙腈提取后正己烷除油净化。采用固相萃取柱净化，步骤复杂且实验成本较高，而乙腈作为提取液，没有兼容到强极性物质的提取，对偏极性的蓄水类药物不能保证回收率。如何把极性物质从水溶液中有效提取出来，这始终是一个艰巨挑战。随着质谱的发展和推广，一次进样完成多类药物残留分析已成为可能。药物残留正逐渐由液相色谱-三重四极杆质谱(LC-MS/MS)目标型检测向高分辨质谱(HRMS)非目标型全扫描检测转变。与传统的LC-MS/MS法相比较，高分辨质谱仪可直接采集高准确度质量数(m/z200,分辨率70 000)，大大降低了近似质量数的干扰，通过自动触发二级，避免了假阳性结果的发生，特别适合高通量的筛查检测。本文利用载体辅助液-液萃取技术，通过一次前处理实现了9种常见注水类药物的提取净化，同时结合四极杆静电场轨道阱高分辨质谱检测，为提高监管工作效率，保证动物源性食品安全提供了基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Q-Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技公司)，配有H-ESI Ⅱ源。UltiMate 3000液相色谱系统，配有自动进样器。硅藻土柱型号为Chromabond XTR(1 000 mg)。

9种蓄水类药物标准品购自Sigma和Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥95%。二甲基亚砜(分析纯)购自南京化学试剂一厂。提取液的配制：称取4.3 g的H2C2O4，用500 mL水溶解，氨水调节pH至3.0。色谱纯甲酸购自美国Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为色谱纯，购自德国Merck公司。实验用水为Milli-Q超纯水(18.2 ΩM·cm)。

1.2 提取净化流程

基质样品来自国家猪肉残留监控抽样和进出口送检企业。称取5.00 g样品，加入10 mL提取液，振荡、各超声5 min，4 500 r/min下离心5 min；取水相上大孔硅藻土柱后，平衡5 min，用10 mL乙腈洗脱2次，下接50 mL离心管，并加入0.5 mL二甲基亚砜，乙腈定容至20 mL；取出10 mL，氮吹后用纯水定容至1.0 mL，过0.22 μm 滤膜，待分析。

1.3 色谱及质谱条件

色谱柱：Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈。梯度洗脱：0～3 min，B相保持5%；3～6 min，B相5%～90%；6～8 min，B相保持90%；8～8.1 min，B相90%～5%。流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。

质谱条件：质谱在正/负离子转换模式下进行全扫描，质量范围：m/z100～500，分辨率70 000，自动增益控制(AGC)目标值5.0×105；4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸采用负离子模式2 700 V，其余成分则采用正离子模式3 800 V；离子传输管温度为300 ℃；鞘气流速(N2)35 L/h；辅助流速(N2)10 L/h；气化室温度350 ℃。在样品运行前对仪器分别进行正、负离子校正；二级采用自动触发模式，分辨率35 000，AGC目标值2.0×105，碰撞能量范围25%～40%，保留时间采集范围：根据一级色谱图中各个目标物的保留时间值±1.0 min。

1.4 定性、定量分析

定性分析时精确质量误差低于5.0×10-6，同时比对保留时间、同位素分布、主要二级碎片和二级质谱图相似度，综合判断，避免假阳性结果出现。

空白样品按照“1.2”处理，在得到的基质溶液中加入上述9种目标物混合标准溶液，配制基质加标溶液并进行测定，以浓度为横坐标，仪器响应值(响应值=标准品峰面积/标准品质量)为纵坐标做标准曲线，作为样品中待测物浓度定量的依据。其中，高浓度加标样品应稀释至标准曲线范围内进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 提取液的选择

考虑到猪肉基质的高脂肪属性，且9种待测物均为碱性化合物,水溶性强,方法采用酸化的水溶液进行提取，在保证9种蓄水类化合物高提取率的同时，又可以防止脂肪被过多的提取出来，降低脂肪的干扰。H2C2O4含有的两个羧基基团，较其他可挥发性甲酸、乙酸，具有更强的稳定性和酸性，此外H2C2O4作为金属螯合剂，可大大降低金属离子的干扰。

2.2 提取剂的添加量对柱填料的影响

提取液的添加量要充分考虑柱子填料的含量，本文选择硅藻土柱Chromabond XTR(1 000 mg)。实验中分别比较了上样量为5 mL、8 mL、10 mL、12 mL、15 mL时柱子的负载情况，在上样量达到12 mL和15 mL时，柱子已达到饱和并渗出，水溶液的渗出会导致氮吹浓缩过程大大延长。另外，当上样量为5 mL和8 mL时，柱子的填料未充分浸入水溶液，大大降低了柱子的利用率，同时对于9种待测药物本就很低的检出限量来说，也增加了仪器检出的难度。因此，本研究最终将上样体积确定为10 mL。

图1 乙腈洗脱体积对9种注水类药物回收率的影响Fig.1 Effect of elution volume of acetonitrile on recovery of 9 waterflooding drugs

2.3 洗脱体积的优化

水相提取液上样后，以纯乙腈作为洗脱液，通过乙腈的逐级渗入，注水类药物按照极性强度依次从饱和的硅藻土柱上洗脱下来。实验中分别考察乙腈作为洗脱溶剂的添加量为10 mL、10 mL×2和10 mL×3对待测物回收率的影响。由图1可见，当乙腈的体积为10 mL×2和10 mL×3时，提取率趋于稳定，9种待测注水类药物在猪肉中的回收率均保持在80%以上。从节约氮吹浓缩的时间和成本的角度出发，确定纯乙腈作为洗脱液的洗脱体积为10 mL×2。

2.4 仪器条件优化

通过注射泵连续进样，对上述蓄水类药物的单标准溶液进行分析，获得每种化合物的最佳电离方式和分子离子峰的存在形式。其中4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和3,4-二羟基扁桃酸采用ESI-模式,其余化合物均采用ESI+模式。

流动相中加入0.1%甲酸能增加正离子模式检测下物质的电离效率,促进[M+H]+离子生成，同时进一步考察NH4Ac添加量对待测化合物的影响，NH4Ac从2 mmol/L到10 mmol/L，结果表明9种蓄水类药物在0.1%甲酸溶液中均获得了最佳的色谱峰形、分离效果和质谱信号响应。从减小仪器污染的角度出发，本文最终采用含有0.1%甲酸水溶液作为流动相A，全程采用梯度洗脱，实现了9种待测物的有效分离。9种注水类药物的提取离子色谱图见图2。

图2 9种蓄水药物的提取离子色谱图Fig.2 Extraction ion chromatograms of 9 waterflooding drugs

2.5 加标回收结果分析

结果表明，肾上腺素及其代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸在5.0～50.0 ng/mL浓度范围内，其他药物(异丙嗪，阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因)在0.5～5.0 ng/mL浓度范围内，各自呈现良好的线性关系，相关系数r2均大于0.990，满足定量要求。9种待测物的回收率在80.0%～95.2%之间，相对标准偏差低于10%。用基质提取液添加低水平的标准溶液(肾上腺素及代谢物为5.0 μg/kg，其他待测物为0.5 μg/kg)，获得每种待测物对应信噪比(S/N)≥10时的含量，以此为该化合物的定量限(LOQ)(表1)。结果表明，该方法灵敏度高，操作简便,适用于猪肉中蓄水类药物残留的快速筛查。

表1 猪肉中9种注水类药物的定量限(LOQs)、线性方程及不同添加浓度的平均回收率(n=6)

3 结论

本研究建立了猪肉中常见的9种蓄水类药物：肾上腺素及其代谢物4-羟基-3-甲氧基-扁桃酸和3，4-二羟基扁桃酸、异丙嗪、阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、普鲁卡因和利多卡因的快速筛查方法。待测物经水溶液提取后,利用硅藻土柱完成水溶性药物的同时提取、净化、浓缩过程。同时结合四极杆静电场轨道阱高分辨质谱，实现了上述药物残留的“一步式”多残留筛查。该方法操作简单,重现性好,定量限低,完全满足国标中规定的猪肉中9种蓄水类药物的测定需求。