幼龄和成年牦牛肌纤维类型、MyHC基因表达及其肌肉抗氧化能力的比较研究

周 力，姚有莉，李蒋伟，马博妍，高占红，桂林生

（青海大学农牧学院，西宁 810016）

肌纤维是组成骨骼肌的基本结构单位，其数量在动物出生时就基本稳定，但肌纤维类型组成可以相互转化[1]，即遵循Ⅰ↔Ⅱa↔Ⅱx/d↔Ⅱb[2]。诸多研究表明，动物肌纤维类型及组成与宰后肌肉品质存在密切的关系[3-4]，主要受品种、营养、性别、环境、运动、应激及生理阶段等多种因素影响[5]。目前通过改变肌纤维类型来提高肌肉品质已经成为食品行业研究的热点，然而主要集中于家禽，对反刍动物（如牛、羊等）的研究较少，关于牦牛不同年龄阶段的肌纤维形态特征更是鲜有报道。

牦牛（Bos grunniens）主要分布于青海、甘肃、云南、新疆和西藏等高海拔地区，约占世界牦牛总量的95%[6]。且肉质鲜美，营养丰富，风味独特，开发潜力大，已成为纯天然的绿色食品[7]。由于生物体不同发育时期对环境适应及自身代谢途径的存在一定的差异性，导致其肌肉组织中表达产物，如mRNA[8]、microRNA[9]以及lncRNA[10]呈现出显著的时序性，使得肌肉组织表型发生变化，在牦牛[11]、黄牛[12]以及绵羊[13]上尤为明显。研究证实，剪切力是衡量牛肉品质重要的指标，能够直接反映牛肉品质的等级[14]。E.W.Miller等[15]根据剪切力的差异，将牦牛肉划分为3个等级。即3岁龄以下的肉属于嫩肉，3～7岁龄的肉属于中等嫩肉，7岁龄以上的属于老肉。当前，随着人们生活品质的提高和膳食结构的调整，其中大理石花纹丰富、口感鲜嫩、风味俱佳的优质高档牛肉在肉品市场供不应求。

基于此，本研究主要聚焦于3岁龄以下的优质牦牛肉，深入了解牦牛生长发育过程中背最长肌中肌纤维类型、直径、横切面积以及密度等的指标变化，同时测定肌纤维类型紧密关联的基因表达水平和抗氧化指标，以期为揭示牦牛肌纤维类型及其转化的调控机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

从青海海北州海晏县自然放牧条件下分别取3月龄和3岁龄健康的牦牛（♂）5头。屠宰后立即取背最长肌，将样品装入冻存管中置于液氮中速冻，带回试验室后置于-80℃冰箱保存。该研究方案由动物福利伦理委员会审查并批准（批准号：20180173）。

1.2 试剂和仪器

二甲苯（广东光华科技股份有限公司）；乙醇（天津富宇精细化工有限公司）；中性树胶（北京索莱宝科技有限公司G8590）；4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司）。德国LEICA2016切片机（德国leica公司）；RX50显微镜（宁波舜宇仪器有限公司）；罗氏LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪（上海罗氏诊断产品有限公司）；赛默飞Varioskan LUX多功能酶标仪（中国赛默飞世尔科技有限公司）。

1.3 测定指标

1.3.1 肌肉抗氧化指标测定

试验牦牛屠宰后，称取背最长肌肉样加PBS（浓度为0.01 mol/L，pH值为7.2～7.4）制备10%组织匀浆液，3 000 r/min离心15 min，取上清液，于-20℃保存待测。抗氧化指标包括总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等。试剂盒购于江苏酶标生物科技有限公司。

1.3.2 肌肉组织学特性测定

将牦牛肌肉沿着肌纤维的垂直方向切成0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的肉块，依次经过4%多聚甲醛固定→流水冲洗30 min→不同浓度酒精脱水（由低到高）→二甲苯透明→石蜡包埋→切片机切片（厚度5～8 μm）→45℃恒温箱烤片→二甲苯脱蜡→HE染色等程序制成石蜡切片。用ATP酶组织化学对牦牛背最长肌进行染色[16]。然后采用RX50显微镜观察并分析肌纤维的各项指标（包括各类型肌纤维直径、横切面积和密度、肌纤维面积比例），测试肌纤维总数不少于1 500根。

①肌纤维直径：测量每根肌纤维横切面上最长两点和最短两点距离，计算其平均值。

②肌纤维横切面积：圈出视野内各型肌纤维的横切面积，测多根求其平均值。

③肌纤维密度：圈出每个视野的面积，计算出每个视野内肌纤维的根数，然后换算成每平方毫米的根数。

④肌纤维面积比例：用每种肌纤维总面积除以总肌纤维面积即为肌纤维面积比例，公式如下：

肌纤维面积比例=各型肌纤维总面积/总肌纤维面积100%

1.3.3 MyHC基因表达量测定

①RNA提取

依据动物组织总RNA提取说明书（北京天根生化科技有限公司）对牦牛背腰最长肌中总RNA进行提取。

②RNA浓度和质量测定

将提取的总RNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，凝胶成像仪拍照，超微量核酸蛋白测定仪检测提取的总RNA的浓度和纯度（A260nm/A280nm）。

③RNA反转录cDNA

按照FastKing RT Kit cDNA第一链合成说明书（北京天根生化科技有限公司）将提取的总RNA进行反转录成cDNA，置于-20℃冰箱保存。

④引物序列与合成

目的基因（MyHC、MyHC a、MyHCⅡb和MyHCⅡx）及内参基因（GAPDH）引物引用参考文献[17]所列。由上海生工生物工程有限公司设计合成。

⑤实时荧光定量PCR扩增

按照的SuperReal PreMix Color（SYBR Green）说明书（北京天根生化科技有限公司）进行，以cDNA为模板，使用罗氏LightCyler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪测定目的基因mRNA表达量。

⑥实时定量PCR产物检测

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测实时定量PCR产物，凝胶成像仪拍照。

1.4 数据统计分析

采用 2--ΔΔCt法分析实时定量 PCR目的基因mRNA的相对表达量[18]，标准曲线通常被用来确定实时荧光定量PCR反应的扩增效率，目的基因相对于内参基因的表达为 ΔCt。计算公式为：ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH。

采用SPSS 21.0软件单因素方差分析，结果以平均值±标准误表示，以P＜0.05作为显著性判断标准，并使用GraphPad Prism 7.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段牦牛肌纤维组织形态学特性

2.1.1 牦牛肌纤维ATP染色结果

采用ATPase组织染色法对3月龄和3岁龄牦牛的背最长肌进行染色，在20×10倍的显微镜下观察，标尺为50 μm，结果如图1所示。经ATP酶染色后肌纤维主要分为3种类型，颜色最深（黑色）的均是Ⅰ型肌纤维，颜色最浅（白色）均是ⅡB型肌纤维，介于两者颜色之间（棕褐色）均是ⅡA型肌纤维。

图1 犊牛和成年牛的Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型肌纤维Figure 1 The type Ⅰ、ⅡA and ⅡB muscle fibers of calves and adults

2.1.2 不同发育阶段牦牛肌纤维直径、横切面积和密度

由图2可知，犊牛背最长肌Ⅰ型和ⅡA型肌纤维直径显著低于成年牛（P＜0.05），ⅡB型肌纤维也呈现低于成年牛趋势，但差异不显著（P＞0.05）；同时犊牛背最长肌Ⅰ型、ⅡA型ⅡB型肌纤维横切面积均显著低于成年牛（P＜0.05）；而肌纤维密度则相反（P＜0.05）。

2.1.3 不同发育阶段牦牛肌纤维面积比例

由图3可知，犊牛Ⅰ型和ⅡA型肌纤维的面积比例大于犊牛（P＜0.05）；不论是成年牛还是犊牛，都以ⅡB型肌纤维面积比例最大，其中犊牛ⅡB肌纤维面积比例为80.61%；成年牛ⅡB肌纤维面积比例为93.95%。表明，随着年龄的增长，牦牛肌肉中ⅡB型肌纤维有所增加，不同年龄会对肌纤维类型的转化产生一定影响。

2.2 不同发育阶段牦牛MyHC基因表达规律

由图4可知，犊牛MyHC 基因和MyHCⅡa基因的mRNA表达量均大成年牛，且在两个年龄阶段差异显著（P＜0.05）；MyHCⅡb基因和MyHCⅡx基因mRNA表达量均为成年牛显著大于犊牛（P＜0.05）；以上说明牦牛MyHC基因表达量受不同年龄阶段的影响较大。

图4 牦牛MyHC基因表达量（n=5）Figure 4 Relative expression levels of MyHC genes in yak （n=5）

2.3 不同发育阶段牦牛肌肉抗氧化能力

由表1可知，成年牦牛肌肉中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和丙二醛等抗氧化指标均无显著差异（P＞0.05）。由此可见，牦牛肌肉抗氧化能力受不同年龄阶段的影响较小。

表1 牦牛肌肉抗氧化能力Table 1 Antioxidant capacity of Bos grunniens at different developmental stages

3 讨论

3.1 不同发育阶段牦牛组织形态学特性的比较

本试验通过ATP酶染色法对牦牛肌纤维分型，发现年龄增加使得背最长肌肌纤维类型由氧化型纤维（MyHCⅠ和MyHCⅡa）向酵解型纤维（MyHCⅡb和MyHCⅡx）转变。该结果与张丽等[19]提出的动物肌纤维类型转化主要发生在生长早期阶段的观点一致。采用qPCR技术对牦牛背最长肌中与肌纤维类型紧密相关的基因表达进行检测后发现，肌纤维类型与MyHCs（MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx）密切相关，即Ⅰ型MyHC基因的表达水平与Ⅰ型肌纤维的数量呈正相关关系；ⅡA型和ⅡB型MyHC基因的表达水平也与ⅡA型和ⅡB型肌纤维数量呈正相关。本研究结果与新疆褐牛、日本和牛等[20-21]黄牛品种上的研究结果一致。

在生产实践中，根据肌纤维直径、单个肌纤维横切面积和肌纤维密度可以判断肉品质的优劣[22]。G.Renand等[23]试验表明，ⅡB型肌纤维比例越高剪切力越大，肉的嫩度越差。G.D.Kim等[24]也发现ⅡB型肌纤维直径与眼肌面积呈正相关，但与嫩度呈负相关。赵雅娟等[25]进一步证实，放牧条件可以降低苏尼特羊背最长肌酵解型纤维类型的比例，有利于其肉品质。以上研究都表明氧化型纤维比例高有利于提高肉质。本试验发现牦牛在成年前酵解型纤维的比例较低，由此可知不同年龄会影响肌纤维类型转变，从而影响其肉质。如何在牦牛成年前控制运动量、降低酵解型纤维类型的比例，改善放牧牛的肉品质是未来的研究重点。

3.2 不同发育阶段牦牛肌肉抗氧化能力的比较

动物肌肉的氧化稳定性主要取决于氧化系统和抗氧化系统之间的平衡，其抗氧化能力越强，保鲜和延长肉品货架期的作用就越明显[26]。T-AOC、SOD、GSH-PX、CAT和MDA等均是衡量机体抗氧化能力的重要指标，其中T-AOC代表了动物机体抗氧化能力的总体水平[27]。SOD是动物体内重要的抗氧化酶，其活性间接反映机体清除自由基的能力[28]。GSH-PX能够通过特异催化还原型谷胱甘肽对过氧化物的还原反应，保护细胞膜避免其受损[29]。而CAT可以促进过氧化氢的分解，从而起到抗氧化作用[30]。MDA含量则是判定机体脂质过氧化程度[31]。因此，测定动物肌肉中抗氧化指标能够反映抗氧化能力的大小，为牦牛的阶段发育情况提供一个理论参考。Cho S.等[32]研究得出，2～12岁韩国肉牛背最长肌中MDA的含量随着年龄增长而逐渐增高，但差异不显著。P.Gatellier等[33]试验也证实，年龄对动物肌肉中抗氧化酶活力的影响仅仅发生在小鼠等小型哺乳动物中，但在大型哺乳动物中影响不明显。本试验的两个年龄组牦牛肉中T-AOC、SOD、GSHPX、CAT和MDA等指标差异不显著，与上述人员的结论基本一致。

综上，3岁龄牦牛与3月龄相比，酵解型肌纤维类型增多，不利于改善肉品质，同时抗氧化能力没有明显差异。