8种竹叶夏季挥发性成分特征

杨 钦，王天星，杨轶雄，马明杨，陈其兵，吕兵洋，江明艳

（四川农业大学风景园林学院，成都 611130）

森林作为最重要的陆地生态系统，有着很重要的生态服务和保健功能，随着城市生活节奏的加快，人们越来越渴望到森林中进行减压放松，健身康体[1]。已有研究报道，森林环境可以降低焦虑和压力水平[2-3]，显著改善抑郁症状[4-5]，具有抗高血压作用[6-7]等，这些都与吸入森林环境中的生物挥发性有机化合物（BVOCs）有着重要关系[8-9]，因为森林中植物释放的BVOCs可以提升空气质量并且引起人和动物愉悦和舒适的感觉[10]，也有一些芳香味的BVOCs可以降低血压和改善情绪[11-12]。这些植物从花到根的所有器官都可以释放BVOCs[13]，其中叶片通过气孔向大气中释放BVOCs并且排放率最高[14]。植物BVOCs的释放具有动态变化，日变化规律一般为白天高晚上低，并且白天呈上升趋势[15]，同时季节变化显著，一般而言夏季BVOCs总浓度最高，春季次之[16-17]。顶空固相微萃取是目前植物活体BVOCs的常见收集方法[18]，它是一种不用有机溶剂的新型萃取技术，集采集、萃取、富集、进样于一体，具有灵敏度高、操作简单和绿色环保的特点。而分析植物有机挥发物最有效的方法是气相色谱-质谱联用仪（GC-MS），可以对样品中全部或指定成分作定性和定量分析[19]。

竹林是森林的重要组成部分，全世界竹林面积占了森林面积的3.9%左右，而亚太竹区为世界最大竹类植物分布区，约占世界竹林总面积的64%[20]，其中中国是亚太竹区最主要的竹资源分布国家之一[21]。近年来，竹林旅游越来越受到人们的关注，国内学者对竹林旅游的研究主要集中在竹文化旅游[22]，竹林生态旅游[23]以及竹林养生旅游[24]的开发模式上，而对竹类植物自身的BVOCs含量成分及其对人体的保健功能的研究较少，目前大中型竹种主要有毛竹[25-27]、紫竹[28]、雷竹[29]、刚竹[30]和苦竹[31]等被研究，并且集中在萜类化合物和异戊二烯的排放规律上。本项研究采用顶空固相微萃取-气质联用法（HSSPME-GC-MS），检测了中国开发利用较充分的8种竹子BVOCs相对含量以及排放种类，并对各竹种间的BVOCs的差异进行比较分析。

1 材料和方法

1.1 风景竹林竹叶BVOCs成分分析

四川省位于中国的西南地区，是中国的混生竹区，具有竹种资源丰富并且适合于多种竹种生长的气候特点。位于四川省成都市的望江楼公园（30°37′N，104°05′E）是著名的竹种园，全园收集了 400多种竹子，其中包括在中国大面积分布的大中型风景竹林竹种。因此在望江楼公园中于2019年8月中旬晴朗无风的天气采集8种大中型竹种（斑竹、紫竹、硬头黄竹、慈竹、梁山慈竹、雷竹、苦竹和吊丝球竹）的健康无损伤叶片50 g，4℃储存运输到实验室立即进行检测。每个竹种的受测叶片均由5株2 a生竹的向阳背风面上、中、下部的叶片均匀混合所得。

对在上述研究地采集到的每种竹叶剪碎并混合均匀，分别称取2 g放置于20 mL顶空萃取瓶中，密封，静置30 min。将型号为50/30 μm DVB/CAR/PDMS（美国Supelco公司）的纤维头通过聚四氟乙烯瓶垫插入到萃取瓶中，置于样品正上方0.5 cm左右，60℃水浴中顶空萃取45 min。然后将纤维头插入QP2010PLUS气相色谱—质谱联用仪（日本岛津）的GC进样口，解吸10 min，同时吸附空萃取瓶中的气体作为空白对照。每种竹叶重复3次。正构烷烃标准品购自Sigma-Aldrich中国公司。

色谱条件：色谱柱为RXi-5ms石英毛细管柱气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。分流比 3∶1；进样口270℃；载气为高纯He气；柱温箱升温程序：40℃保持5 min，然后5℃/min升温到120℃保持2 min，然后10℃/min升温到280℃保持3 min；吹扫流量：5 mL/min。质谱条件：离子源为EI（electron ionsizations）；电离能 70 eV；辅助加热区 280 ℃；离子源200℃；接口温度为220℃；采集模式为全扫描；质量扫描范围（m/z）33～500；溶剂延迟 0.1 min。

取正构烷烃混合标准样品C5-C8，C8-C20各1μL，按照上述同样步骤分析，记录各成分的保留时间，计算各成分的 LRI值（线性保留指数），其中，tx，tn和tn+1分别是待分析组分和碳原子数目处于n和n+1之间的组分（tn＜tx＜tn+1）的出峰保留时间。

进行GC-MS分析，采集所得到的总离子流色谱图，利用NIST08.LIB谱库对得到的质谱图进行串联检索，同时采用保留指数定性的方法和参考文献方法来辅助质谱检索定性[32]。依据总离子流色谱峰的峰面积归一法进行定量分析，计算各样品组分的相对含量。

1.2 数据处理

使用Excel 2017和Origin 18.0整理数据并绘图，使用PAST 3.0软件计算Bray-Curtis相似性指数并绘制聚类分析图与主成分分析图。

2 结果与分析

2.1 8种竹叶BVOCs组成和含量

通过GC-MS分析，扣除本底空气中的杂质，离子流色谱图如图1，并根据保留时间列出化合物。从夏季8种竹叶释放的BVOCs中共鉴定出105种化合物（表 1），共有的 BVOCs有 20种：叶醇、2-己烯醛、芳樟醇、甲酸正己酯、1-辛烯-3-醇、3-己烯醛、3-辛酮、顺-2-戊烯醇、3,5,5-三甲基己-2-烯、1-戊烯-3-醇、β-环柠檬醛、反式-2-己烯-1-醇、2-乙基己醇、2-己炔-1-醇、辛醇、异戊醇、壬醛、β-紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、乙酸叶醇酯。

图1 夏季8种竹叶BVOCs色谱图Figure 1 Total ionic chromatogram of BVOCs in leaves of eight bamboo species in summer

从鉴定的化合物种类来看（见表1，表2），斑竹（58种）＞苦竹（56种）＞紫竹（53种）=雷竹（53种）=慈竹（53种分）＞吊丝球竹（50种）＞梁山慈竹（48种）=硬头黄竹（48种）。并且8种竹叶化合物种类主要为醇类，醛类和酯类，这3种类型的化合物的平均值分别为58.61%，21.21%和8.25%，占总化合物的88.07%。从图1和表1可以发现8种竹叶的BVOCs中叶醇是含量最多的化合物，平均占总BVOCs的38.89%，其中雷竹（48.99%）＞苦竹（47.77%）＞紫竹（42.38%）＞吊丝球竹（40.43%）＞硬头黄竹（37.06%）＞斑竹（36.76%）＞梁山慈竹（34.21%）＞慈竹（23.50%）。6个竹种的BVOCs含量第二的是2-己烯醛，分别为吊丝球竹（24.71%）＞苦竹（20.66%）＞紫竹（18%）＞慈竹（16.67%）＞雷竹（16.65%）＞斑竹（10.73%），而梁山慈竹和硬头黄竹BVOCs含量第二的分别为乙酸叶醇酯（11.32%）和1-辛烯-3-醇（10.35%）。在105种化合物中，特有化合物种类拥有最多的是斑竹（8种），分别为正戊醇 、（+）-环苜蓿烯、β-石竹烯、香树烯、巴伦西亚橘烯、α-衣兰油烯、（+）-γ-卡丁烯和正十三烷，占了总成分的4.35%，并且这些特有化合物主要集中在萜烯类。特有化合物拥有第二多的是慈竹（6种），为月桂烯、（E）-B-罗勒烯、庚醛、樟脑、2,5-辛二酮、5-甲基-1-己醇，这些特有成分占总BVOCs的0.78%。

表2 夏季8种竹叶BVOCs种类组成Table 2 Composition of BVOCs of eight kinds of bamboo leaves in summer

2.2 各竹种间BVOCs差异

Bray-Curtis相似性指数是用于对比两个样本相似性的统计数据[33]，表3可以得出8种竹叶Bray-Curtis相似性指数范围为56.97%～88.46%，均值68.46%，说明不同竹种之间的BVOCs的组成和含量存在一定的相似性。但有些竹种之间相似性指数不高，如梁山慈竹和苦竹（56.97%），梁山慈竹与雷竹（57.48%）等，说明不同竹种的BVOCs也存在一定差异性，因此需要进一步分析。

表3 8种竹叶BVOCs的Bray-curtis相似性指数Table 3 Bray-curtis similarity index of BVOCs of eight kinds of bamboo leaves

对8种竹叶的挥发性成分组成进行聚类分析（图2），硬头黄竹和梁山慈竹共有的化合物有37种，并且主要化合物含量相似，特有成分较少，聚为一类；苦竹、雷竹和紫竹共有的化合物有40种，主要化合物含量相似，聚为一类；斑竹、吊丝球竹与苦竹、雷竹、紫竹的特异性成分有较大差异但含量不高，且这5个竹种共有的化合物有23种，主要化合物种类差异不大，因此可以聚为一个大类。由于慈竹所含有的特有成分较多，并且与其他竹种的主要成分存在较大的差异，因此慈竹归为最特殊的一类。

图2 8种竹叶BVOCs聚类分析Figure 2 Cluster analysis of BVOCs of eight kinds of bamboo leaves

为了确定主要的50种化合物（出现频率≥80%）对8种竹叶BVOCs之间的差异贡献，使用主成分分析（PCA）分析了50种化合物的数据，PCA的前3个组成部分解释了54.51%，26.99%和10.38%的变异，即91.88%的组合方差（图3）。通过PCA分析可以发现，在8种竹叶BVOCs中可以看出明显差异。硬头黄竹与梁山慈竹分布区域接近，为一种类型，主要BVOCs为叶醇、1-辛烯-3-醇、乙醇、乙酸叶醇酯、2-己烯醛；紫竹、苦竹和雷竹的分布区域接近，为一种类型，主要BVOCs为叶醇、2-己烯醛、3-己烯醛、甲酸正己酯、芳樟醇；吊丝球竹、斑竹的主要化合物含量与紫竹、苦竹、雷竹有一定差异，因此它们的分布区域与这3种竹种相距较远；慈竹的分布区域最远，为最特殊的一类型，主要BVOCs为叶醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、2-己烯醛、甲酸正己酯。上述结果与图2的结果是相似的，说明各竹种间BVOCs的差异性是由含量多的化合物来决定。

图3 8种竹子竹叶BVOCs的主成分（PC1，PC2和PC3）分析图Figure 3 Main components（PC1，PC2 and PC3）of BVOCs of eight kinds of bamboo leaves

3 讨论与结论

本研究检测出的8个竹种释放的BVOCs有48到58种化合物，相较前人对白松（41种）[34]、油松（19种）、白皮松（21种）、桧柏（19种、红皮云杉（17种）、雪松（21种）[35]等松柏植物以及毛竹（23～33种）[26，36]的研究而言，挥发性有机化合物含量普遍偏多，这可能是因为使用的方法不同，前人对挥发性有机化合物的检测多用热处理的方法，而本实验使用的方法是顶空固相微萃取，因此可以检测出更多类型的化合物，并且也说明竹类植物有较强的释放BVOCs的能力。目前挥发性有机化合物的研究主要针对松柏类[34-35，37-38]以及花卉[39-41]，主要 BVOCs 是异戊二烯、萜类化合物、烷烃、酮类、酸类、醛类等。关于竹类植物的研究较少，其中毛竹排放的BVOCs主要为醇类、醚类与醛类[26，36]，紫竹BVOCs排放主要为异戊二烯、醇类、醛类等[29]，刚竹排放的BVOCs有醛类、烯类、醇类、酮类、酯类、萜类和酸类7类化合物[30]，苦竹主要为烷类和萜烯类[31]，巴山木竹、金佛山方竹、筇竹和峨眉箬竹竹叶主要释放包括酯、醇、酸、醛、酮、萜烯烃类及少量酚类等成分[42]，而雷竹可以排放大量的异戊二烯[15]。本实验中并未检测出异戊二烯，这也与研究方法有关。前人用固相微萃取法检测BVOCs的结果中异戊二烯的含量普遍较少[40-41]，这与本项研究结果一致。8种竹叶中释放较多的BVOCs有叶醇、2-己烯醛、甲酸正己酯、1-辛烯-3-醇、3-己烯醛、芳香醇，其中叶醇、3-己烯醛和2-己烯醛具有青草气味[43-44]，这三者混合在一起时可降低人脑的α-波的振幅值，从而减少人的压抑感[45]，芳樟醇可以使心率减慢，让紧张的情绪得到缓解[46]。此外，叶醇、壬醛、癸醛、1-辛醇、紫罗兰酮、苯甲醛和苯乙醛等都具有良好的抗菌活性[35，47]，但是竹类植物不同化学成分之间涉及了复杂的协作机制，具体的保健功效还需进一步研究。

研究发现，8种竹类植物的BVOCs中含量最高的都是叶醇，由于叶醇具有青草香气，因此8种竹类植物均具有康养保健的潜力。但是，8种竹类植物的BVOCs也存在差异，这与O.Motonori等人指出12种竹类植物BVOCs的挥发性成分组成存在差异的研究结论相似[27]，说明了竹类植物BVOCs的复杂性与差异性。梁山慈竹和硬头黄竹不仅叶醇含量较高，而且含有较多的乙酸叶醇酯和1-辛烯-3-醇，因此这两个竹种相较于其他竹种更具有强烈的清香味[48-49]。慈竹则具有最多的特有成分，其中月桂烯具有令人愉快的甜香脂气味，可兴奋中枢[50-51]，且对肺黏液呼吸道阻塞的清除具有积极作用[52]；（E）-B-罗勒烯具有草香、花香味，并具有抗氧化和抗菌活性[53]，樟脑具有较强的抗氧化能力以及抑菌作用[54]，表明慈竹在BVOCs方面的康养保健效果有进一步挖掘和开发利用的可能性。虽然慈竹特有成分含量较低，但是可以通过栽培或遗传调控措施的进一步研究，提高其特有的保健功能性BVOCs的含量，为竹林康养旅游开发提供理论和实践支撑。

综上，本研究发现8种竹叶BVOCs排放种类有105种，共有的BVOCs有20种，并且8种竹种相对含量最高的化合物都为具有青草香味的叶醇，均具有一定的保健功效。对8种竹种BVOCs的组成和含量进行聚类分析，可将其聚为3类，硬头黄竹和梁山慈竹为一类，苦竹、雷竹、紫竹、斑竹和吊丝球竹为一类，慈竹为最特殊的一类。