柴胡加龙骨牡蛎汤“异病同治”冠心病和焦虑症的网络药理学作用机制

靳会会，黄乐曦，侯季秋，陈雅丽，史金玉，安 莹，赵海滨

随着生物-心理-社会医学模式的建立，情志因素在疾病发生发展中的重要作用逐渐受到重视。冠心病是公认的心身疾病，焦虑症状或焦虑症显著增加冠心病的发生风险[1]，影响治疗及预后，两者病理互损，导致恶性循环。“双心”异常已逐渐成为冠心病的重要发病形式和国内外心血管病学界的研究热点[2]。

柴胡加龙骨牡蛎汤出自《伤寒论》，由柴胡、黄芩、人参、茯苓、桂枝、半夏、大黄、龙骨、牡蛎、大枣、铅丹(现由珍珠母代替)、生姜12味药组成，是治疗情志类疾病的经典方剂。近年来药理研究及动物实验表明，柴胡加龙骨牡蛎汤治疗双心疾病疗效确切，该方不仅能干预动脉粥样硬化，对儿茶酚胺所致的心血管损伤具有保护作用，还可逆转下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴亢进、修复应激导致的海马神经元损伤，并通过调节中枢神经发挥抗焦虑等作用[3-5]，对心脏的生理功能和病理状态均产生一定的影响。柴胡加龙骨牡蛎汤成分复杂，现有研究多局限于单一靶点和通路，治疗冠心病和焦虑症共病的作用机制研究尚不明确。本研究应用网络药理学方法，从分子角度分析柴胡加龙骨牡蛎汤的活性成分靶点与疾病之间的关联性，构建活性成分、靶点、疾病、通路之间的多种网络关系，旨在为临床研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 中药活性成分与靶点预测 检索TCMSP数据库[6](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18和药物对小肠上皮细胞的穿透性(Caco-2)≥0.4为条件，初步筛选柴胡加龙骨牡蛎汤植物药(柴胡、黄芩、人参、茯苓、桂枝、半夏、大黄、生姜、大枣)的活性成分及对应的靶点信息，并根据已发表的文献补充未预测到的活性成分的已知靶点。登录BATMAN-TCM数据库[7](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)获得矿物药(龙骨、牡蛎、珍珠母)可信度高的蛋白作为候选靶点。通过Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)将上述预测靶点进行校正和转化操作，最终获得柴胡加龙骨牡蛎汤活性成分的靶点信息。

1.2 疾病靶点筛选 利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以“coronary heart disease”“anxiety disorder”为关键词检索与冠心病和焦虑症相关的靶点。将上述成分靶点与疾病靶点进行匹配，分别获得柴胡加龙骨牡蛎汤治疗冠心病和焦虑症的潜在作用靶点，通过Venn diagram在线程序绘制韦恩图进行分析。

1.3 靶蛋白相互作用网络构建 将柴胡加龙骨牡蛎汤治疗冠心病和焦虑症的共有靶点导入STRING平台(https://string-db.org/)进行蛋白分析，限定物种为“homo sapiens”，选择置信度为0.400，其余参数保持默认设置，结果以TSV格式导出，根据分析结果统计靶点关联频次，得到核心靶点信息。其中网络的粗细代表相互作用强弱，靶点的度值表示相互作用的靶点个数。

1.4 靶点通路注释分析 为较好地了解核心靶点的功能及在信号通路中的作用，利用R语言的org.Hs.eg.db程序包，将基因symbol转化为基因ID，之后安装colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等程序包，对获取的基因分别进行基因本体(GO)富集分析及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，设定阈值P<0.05。按照涉及的靶点数量进行排序，绘制柱状图和点图。

1.5 活性成分-靶点-通路网络构建 利用Cytoscape 3.7.1软件(http://www.cytoscape.org/)构建活性成分-靶点-通路共表达网络，借助Network Analyzer功能对网络的拓扑性质进行分析，研究基于自由度、紧密度、介度中心性等参数以评估节点在网络中的重要性。

1.6 分子对接验证 分子对接是分子通过能量、化学环境等相互识别找到最佳匹配模式的过程。采用Auto Dock vina软件对PPI网络中度值居前3位的靶蛋白与柴胡加龙骨牡蛎汤主要活性成分进行分子对接，从Chem Office软件和RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)分别获得化合物和靶蛋白的3D结构，利用PyMOL软件对蛋白质进行去水、加氢等处理，借助Auto Dock软件将化合物和靶蛋白格式转化为＊pdbqt格式，最后通过Vina进行对接。根据结合能值评估化合物与靶蛋白的结合强度与活性。

2 结 果

2.1 活性成分及靶点获取 经TCMSP数据库筛选得到植物药活性成分共102个，其中柴胡9个，黄芩29个，茯苓5个，人参17个，桂枝3个，大黄5个，半夏10个，生姜5个，大枣19个。通过BATMAN-TCM数据库，在Score cutoff>20条件下，得到矿物药活性成分共7个。将上述两个数据库所得活性成分预测产生的靶点合并去重后获得靶点175个。

2.2 疾病相关靶点获取 从GeneCards数据库得到冠心病相关靶点6 567个，焦虑症相关靶点2 887个，确定疾病共有靶点1 380个。将柴胡加龙骨牡蛎汤活性成分靶点与两种疾病共有靶点取交集，利用Venn diagram软件绘制韦恩图，得到活性成分-疾病共有靶点92个，详见图1。将共有靶点与活性成分匹配后发现74个有效活性成分参与调控92个作用靶点，其中豆甾醇为柴胡、黄芩、人参、半夏、生姜、大枣共有化合物；黄芩素为黄芩与半夏共有化合物；谷甾醇为黄芩与桂枝共有化合物等，提示柴胡加龙骨牡蛎汤中相同的化合物对应多种不同药材，多个靶点可对应相同化合物，初步推测上述结果可能是柴胡加龙骨牡蛎汤发挥“异病同治”功效的关键。74个有效活性成分信息详见表1。

图1 柴胡加龙骨牡蛎汤与冠心病、焦虑症交集靶点韦恩图

表1 柴胡加龙骨牡蛎汤有效活性成分信息

(续表)

2.3 靶蛋白PPI网络分析及核心靶点结果 将共有靶点上传至STRING平台，隐藏4个游离的无相互作用蛋白，进而得到由88个靶蛋白参与的PPI网络，详见图2。该网络包含88个节点、412条边，其中紫色线代表经过实验验证的蛋白间相互作用，浅蓝色线代表从数据库中获得的蛋白间相互作用。分析网络中参数信息，将自由度排名居前30位的节点进行统计及可视化处理，结果提示靶标中度值排名居前5位的分别为苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、白细胞介素6(IL-6)、转录因子AP-1(JUN)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素8(CXCL8)。自由度作为关键的拓扑特征值之一，表示与某点连线的边的数量，度值越大说明该靶点与更多的靶标存在靶向联系，因此在网络中的作用也越重要，核心靶点柱状图详见图3。

图2 靶蛋白相互作用网络图

图3 核心靶点柱状图

2.4 靶点功能与通路富集分析 借助R语言对92个交集靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，根据P<0.05选取排名居前20位的条目进行分析。GO分析确定了118个生物学过程相关的条目，主要涉及蛋白异源二聚化活性、离子跨膜转运蛋白活性、G蛋白偶联胺受体活性、神经递质受体活性、RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合、类固醇结合、核受体活性、类固醇激素受体活性等，详见图4。KEGG通路分析结果显示：神经活性配体-受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号转导、钙信号通路、丝裂原活化蛋白激酶B(MAPK)信号通路、IL-17信号通路、5-羟色胺能突触、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶(Akt)信号通路、cGMP-PKG信号通路、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路等在柴胡加龙骨牡蛎汤治疗冠心病和焦虑症共病过程中均发挥着重要作用，详见图5。

图4 柴胡加龙骨牡蛎汤治疗冠心病合并焦虑症共有靶点的GO生物过程

图5 柴胡加龙骨牡蛎汤治疗冠心病和焦虑症共有靶点的KEGG通路富集分析

2.5 活性成分-靶点-通路网络的构建 利用Cytoscape 3.7.1软件构建活性成分-靶点-通路网络图，详见图6，借助其插件Network Analyzer进行分析。该网络包括186个节点和982条边，深绿色节点代表靶点，粉色节点代表活性成分，紫色节点代表通路，网络节点大小与自由度呈正相关，节点越大表明度值越高。网络分析表明，β-谷甾醇自由度为140，紧密度为0.421 2，介度为0.076 4，因此，预测β-谷甾醇是柴胡加龙骨牡蛎汤治疗冠心病和焦虑症共病的主要活性成分，其次为豆甾醇(自由度为108，紧密度为0.402 6，介度为0.086 5)、黄芩素(自由度为30，紧密度为0.380 7，介度为0.049 8)，详见表2。从靶点角度分析，度值较大的靶点包括PTGS2、SCN5A、NCOA2、ADRB2、ADRA1B、CASP3、BCL2等，可能是柴胡加龙骨牡蛎汤发挥作用的主要靶点。该网络图表明柴胡加龙骨牡蛎汤通过多成分、多靶点、多通路协同调控而发挥“异病同治”的作用。

表2 柴胡加龙骨牡蛎汤主要活性成分的拓扑属性参数

图6 活性成分-靶点-通路网络图

2.6 分子对接结果 将PPI网络中度值排名居前3位的靶蛋白与柴胡加龙骨牡蛎汤主要活性成分进行分子对接验证，详见表3。当结合能<0说明配体和受体可自发结合，结合能<-5 kcal/mol，表示有较好结合活性，结合能分值越低对接效果越佳[8]。分子对接结果显示，柴胡加龙骨牡蛎汤的主要活性成分β-谷甾醇、黄芩素与3个靶蛋白的对接亲和力均<-5 kcal/mol，表明筛选出的活性成分与靶蛋白均能较好的结合，其中β-谷甾醇与受体AKT1的结合活性最强，详见图7。

表3 柴胡加龙骨牡蛎汤主要活性成分与核心靶点的结合度

3 讨 论

近年来，双心医学日益受到重视，心脏合并心理异常“双心”疾病常互为因果，冠心病与焦虑症共病的病人当以“双心同治”为治疗原则[9]。中医学认为冠心病属“胸痹”“心痛”范畴，焦虑症属“郁证”范畴。《内经》中已记载“心主血脉”与“心主神明”的双心理论，而中医“形神合一”与“双心医学”理念不谋而合。中医药治疗双心疾病疗效确切，尤其改善症状方面具有极大潜力。王克鹏[10]通过临床试验证实采用柴胡加龙骨牡蛎汤联合常规西药治疗稳定型心绞痛伴焦虑，治疗后病人胸痛、胸闷症状积分升高，同时焦虑症状显著减轻，疗效优于对照组，显示出安神除烦的功效。许国磊等[11]研究显示，柴胡加龙骨牡蛎汤加减治疗的治疗组焦虑评分、生活质量评价指标、疗效等均优于对照组。本课题组前期研究发现，柴胡加龙骨牡蛎汤能改善病人心绞痛症状，缓解焦虑状态；促进心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞动员、归巢及旁分泌，抑制炎症反应和心肌梗死后交感重构，从而改善心肌梗死后心肌损伤及焦虑程度[12-13]。

本研究采用网络药理学方法初步筛选出柴胡加龙骨牡蛎汤治疗冠心病和焦虑症共病的主要活性成分包括β-谷甾醇、黄芩素、谷甾醇、黄连素、人参二醇等。有研究显示，β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎症、降低胆固醇、调节中枢神经系统、免疫调节和抗肿瘤等作用[14]。黄芩素预处理可能通过激活内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路和抑制氧化应激反应，对急性心肌梗死产生心脏保护作用[15]。黄芩素抗氧化应激和抗炎的机制主要通过改善超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的抗氧化酶活性，减少活性氧(ROS)和丙二醇产生，抑制白细胞介素1(IL-1)、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)1等炎性因子表达[16]。Yadav等[17]研究发现，豆甾醇能明显减少氯胺酮诱发的小鼠自发活动、刻板行为及潜伏期等精神病症状，增加γ-氨基丁酸和谷胱甘肽水平，降低多巴胺、丙二醛、TNF-α水平和乙酰胆碱酯酶活性，显示出豆甾醇对精神病症状有一定的改善作用。

冠心病和焦虑症具有AKT1、IL-6、JUN等92个共有靶点，74个活性成分，121条共同通路，冠心病与焦虑症相似的作用功效是柴胡加龙骨牡蛎汤对两个不同系统疾病“异病同治”的作用基础。PPI网络分析发现各靶标之间关联密切，自由度越大表明该靶点在网络中参与调控的可能性越大，预测到共有靶点是冠心病和焦虑症治疗的重要靶点。AKT1、IL-6、JUN是PPI网络中度值排名较高的关键靶点，分子对接证实这3个受体蛋白与β-谷甾醇、黄芩素具有较好的结合活性。AKT1是3种密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的亚型(AKT1、AKT2、AKT3)之一，处于多条信号通路的交叉点，通过影响下游多种因子活化，介导细胞存活、增殖与凋亡、新生血管形成、动脉粥样硬化及细胞周期调控等多种生理过程[18-19]。IL-6是一种炎性因子，主要由活化的成纤维细胞和T细胞产生，参与炎症反应。IL-6通过与其他促炎因子形成级联反应，是冠心病的独立危险因素[20]。相关研究发现，焦虑、抑郁病人IL-1、IL-6和C反应蛋白等炎性因子水平较对照组升高，免疫炎症反应增强[21]。JUN蛋白(v-Jun、c-Jun、JunB和JunD)是核转录因子AP-1家族的成员，AP-1复合物典型结构是由c-Fos与c-Jun结合形成的异源二聚体，AP-1与DNA结合后调控多种基因的表达，主要通过调节VEGF诱导内皮细胞迁移、增殖与血管生成[22-23]。神经元凋亡过程中JNK/c-Jun通路激活发挥着重要作用，c-Jun持续性表达和磷酸化是神经细胞凋亡所必需的，应用特异性阻断剂阻断JNK/c-Jun通路，结果表现出抑制凋亡的保护效应[24-25]。上述相关重要靶标的作用与分子对接结果表明，AKT1、IL-6、JUN可能是柴胡加龙骨牡蛎汤发挥药效作用的关键靶点，间接验证网络药理学预测结果的准确性，柴胡加龙骨牡蛎汤主要通过抗凋亡、抗炎、血管新生、调节焦虑及抗动脉粥样硬化等作用充分体现“异病同治”的治疗思想。

GO富集分析结果表明，相关作用靶点主要参与蛋白异源二聚化活性、离子跨膜转运蛋白活性、G蛋白偶联受体活性、神经递质受体活性、RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合、转录因子活性等生物学过程。KEGG富集分析发现，柴胡加龙骨牡蛎汤作用靶点富集度最高的相关通路中MAPK信号通路是生物体中重要的信号转导通路之一，存在于多数细胞内，其在细胞增殖、分化、转化和凋亡等过程中发挥重要的作用[26]。PI3K/AKT信号通路激活可诱导炎性细胞的聚集促进炎症反应从而加速动脉粥样硬化进展，AKT是PI3K信号通路下游的一个重要靶蛋白，活化的AKT通过磷酸化作用，调控下游多个靶蛋白促凋亡分子Bcl-2/Bcl-xL相关的死亡启动因子、eNOS等，进而调节细胞增殖、凋亡、分化及迁移等[27-28]。5-羟色胺能突触通路是由5-羟色胺和分布于脑内不同部位的突触前后膜上各类5-羟色胺受体组成，可影响γ-氨基丁酸、多巴胺等其他神经递质释放，介导情感、学习、记忆、行为等大脑高级活动，其功能改变引起焦虑症、抑郁症和老年痴呆等情志疾病发生[29]。柴胡加龙骨牡蛎汤可调节其他多条通路，在神经活性配体-受体相互作用、内分泌抵抗、心肌细胞中的肾上腺素能信号转导等方面发挥重要的作用，这与中医药治疗的整体观念一致，符合中药多成分、多靶点、多通路协调治疗疾病的特点。

综上所述，本研究在生物信息学基础上，对柴胡加龙骨牡蛎汤“异病同治”冠心病和焦虑症的作用机制进行探讨，为进一步实验研究和临床应用提供了新思路。本研究存在的不足：仅从理论方面对柴胡加龙骨牡蛎汤作用机制进行了预测，未明显提示活性成分对关键基因表达的上调与下调关系，但未考虑药物、靶点、疾病之间作用强度的差异，今后仍需进一步研究验证。