牡蛎礁修复的底物筛选：新、旧牡蛎壳附苗效果比较

姜 伟，孙兆跃，施文静，范瑞良，李楠楠，全为民

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海渔业资源开发重点实验室，上海 200090）

牡蛎礁是由大量牡蛎聚集生长而形成的一种生物礁系统，具有净水、去氮、固碳、提供栖息地和防止海岸线侵蚀等生态系统服务功能［1-4］。然而，过度捕捞、环境污染、病害和生境破坏等导致全球约85%牡蛎礁已经消失［1，5］。近几十年来，美国、澳大利亚、欧洲和中国等陆续开展了不同尺度的牡蛎礁修复项目［6-7］。早期修复项目的目标是增殖牡蛎种群、恢复过去繁荣的牡蛎产业，而最近大多数修复项目的侧重点则是牡蛎礁提供的生态系统服务功能［6-8］。

牡蛎是生长于硬底物上的双壳类软体动物，建造适合于牡蛎幼虫附着的栖息生境（礁体）是牡蛎礁修复的重点［6-7，9］。牡蛎壳是牡蛎幼虫附着和稚贝生长最适合的底物（substrate），早期的牡蛎礁修复项目通常优先使用循环回收的本地牡蛎壳建造礁体［6-7］。但由于牡蛎壳资源量和可获取性的制约，许多牡蛎礁修复项目则使用旧（old）牡蛎壳、蛤壳、混凝土、石块、竹子、木材、塑料和橡胶等替代底物［6-7］。研究表明，各种底物的附苗效果通常随着时间、地点和项目设计而有较大差异［6-9］。

牡蛎礁修复中使用的牡蛎壳分为两类：一类为活牡蛎被食用后循环回收的新牡蛎壳（以下简称新壳），另一类为从自然牡蛎礁或海底疏浚回收的旧牡蛎壳（以下简称旧壳）。由于经济成本低和资源量大，旧壳被大量地应用于牡蛎礁修复中［7］。然而，目前少见比较新、旧壳对牡蛎幼虫附着的诱导力和生物接受度的研究［6-7］。另外，笔者在江苏海门蛎岈山和福建深沪湾牡蛎礁野外调查中均发现：牡蛎礁表面的旧壳上几乎没有牡蛎稚贝补充（recruitment），而新壳和人工海堤上分布着高密度的活体牡蛎。

本研究采用室内和野外附着实验，比较了新、旧壳的附苗效果，检验了生物膜对新、旧壳附苗效率的影响，比较了2个潮区中新、旧壳上牡蛎和藤壶附着量的差异，评估了新、旧壳作为牡蛎礁修复底物的适宜性，以期为指导牡蛎礁修复和牡蛎增养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用的两种牡蛎壳均采自江苏海门蛎岈山牡蛎礁。新壳为活体近江牡蛎（Crassostrea ariakensis）成体的左壳；旧壳为蛎岈山牡蛎礁剖面下层的死亡近江牡蛎的左壳，经14C年代测定法测得其年龄为279～86 a BP。牡蛎壳经去除表面污损生物、清洗和太阳曝晒后备用。

1.2 实验方法

1.2.1 牡蛎壳和生物膜对牡蛎附着量影响的实验设计

室内附着实验于2019年6—7月在北部湾大学钦州实验基地开展。采用双因子随机区组实验设计，2个自变量为牡蛎壳（新壳和旧壳）和生物膜（有生物膜处理组和无生物膜对照组）。有生物膜处理组：挑选形态大小基本一致的新、旧壳各1只组成一个试验组，放入流动的300目筛绢网过滤的自然海水中浸泡72 h作为生物膜处理，设置5个实验重复。无生物膜对照组：挑选形态大小基本一致的新、旧壳各1只组成一个试验组，保持干燥作为无生物膜处理，设置5个实验重复。实验所用的牡蛎壳拍照后使用ImageJ软件（1.46R）测定其表面积。当育苗池（3 m×5 m×1.5 m）内人工培育的熊本牡蛎（Crassostrea sikamea）浮游幼虫大部分处于眼点幼虫（幼虫密度约2个·L-1）期时，将各试验组牡蛎壳吊挂于育苗池水面下1 m处进行附苗，实验水温28℃、盐度24，3 d后移至苗种培育池中暂养，15 d后对实验牡蛎壳上附着的牡蛎稚贝进行计数，牡蛎附着量统计为单位牡蛎壳表面积内稚贝的数量（个·cm-2）。

野外附着实验在浙江省象山港底部的熊本牡蛎自然采苗区开展。实验设计与上述室内实验一致。2019年7月26日将各试验组牡蛎壳吊挂于牡蛎附苗筏架上，保持所有牡蛎壳处于相同潮区（平均最低低水位以上1.2 m），实验期间海水温度27～29℃、盐度22～24；2019年9月4日回收实验牡蛎壳，于室内对牡蛎壳上附着的牡蛎稚贝进行计数，牡蛎附着量统计为单位牡蛎壳表面积内稚贝的数量（个·cm-2）。

牡蛎附着量数据经正态性检验和方差齐性检验后，采用双因子方差分析（two-way ANOVA）检验牡蛎壳和生物膜对牡蛎附着量的影响，采用Tukey后检验进行多重比较（α＝0.05），统计分析在Sigmaplot 10.0软件中完成。

1.2.2 牡蛎壳和潮区对牡蛎和藤壶附着量的影响实验设计

本实验于2020年7—9月在浙江省三门县健跳港上游潮间带牡蛎养殖区开展。该水域牡蛎优势种为熊本牡蛎，幼虫附着补充高峰期为8月，实验期间水温25.0～32.2℃、盐度7.2～24.9。采用双因子随机区组实验设计，2个自变量为牡蛎壳（新壳和旧壳）和潮区（滩面以上0.6 m和1.1 m）。在潮间带低潮区沿平行于水边线方向搭建附苗架，相邻附苗架间相距10 m，每个附苗架设置2个潮区水平，每个潮区设置5个实验重复。挑选形态大小基本一致的新、旧壳各1只组成1个试验组，2020年7月7日将10个试验组牡蛎壳分别固定到5个附苗架的不同潮区，所有牡蛎壳均水平固定、其内表面朝上。分别于15 d（7月22日）、45 d（8月22日）和70 d（9月17日）后，对实验牡蛎壳上附着的牡蛎和藤壶进行计数；从同一处理水平的试验组中分别随机选取30只牡蛎稚贝，使用游标卡尺测量其壳高。运用双因子方差检验牡蛎壳和潮区对牡蛎和藤壶附着量以及牡蛎壳高的影响，数据统计方法见1.2.1。

2 结果与分析

2.1 牡蛎壳和生物膜对牡蛎附着量的影响

双因子方差分析结果表明：在2019年室内附着实验中，牡蛎壳和生物膜均显著影响牡蛎附着量（表1，P＜0.05），2个因子之间没有显著的交互作用（表1，P＞0.05）。牡蛎壳和生物膜对牡蛎附着量的影响如图1-A所示，在生物膜处理下，新、旧壳上牡蛎附着量的大小顺序为：新壳＞旧壳（P＜0.05）；而在对照组中，新、旧壳间牡蛎附着量无显著差异（P＞0.05）。生物膜显著提高了新壳的附着量（P＜0.05），但对旧壳的附着量无显著影响（P＞0.05）。

在2019年野外附着实验中，牡蛎壳和生物膜均显著影响牡蛎附着量（表1，P＜0.05），2个因子之间存在显著的交互作用（表1，P＜0.05）。牡蛎壳和生物膜对牡蛎附着量的影响如图1-B所示，在生物膜处理下，新、旧壳上牡蛎附着量没有显著差异（P＞0.05）；而在对照组中，牡蛎附着量的大小顺序为：新壳＞旧壳（P＜0.05）。生物膜显著提高了旧壳的牡蛎附着量（P＜0.05），但对新壳的牡蛎附着量没有显著影响（P＞0.05）。

2.2 牡蛎壳和潮区对牡蛎和藤壶附着量的影响

双因子方差分析结果表明：在2020年野外附着实验中，牡蛎壳显著影响了牡蛎附着量（表2，P＜0.01），而潮区对牡蛎附着量没有显著影响（表2，P＞0.05），2个因子之间无显著的交互作用（表2，P＞0.05）。在每个潮区中，新、旧壳15 d、45 d和70 d时牡蛎附着量的大小顺序均为：新壳＞旧壳（图2，P＜0.05）。新壳上牡蛎附着量的时间变化为：45 d和70 d均显著高于15 d（图2，P＜0.05）；旧壳上牡蛎附着量的时间变化0.6 m潮区中也呈现上述特征（图2-A，P＜0.05），而在1.1 m潮区中旧壳上牡蛎附着量在各附着周期内均无显著差异（图2-B，P＞0.05）。

表1 牡蛎壳和生物膜对牡蛎附着量影响的二维方差分析结果Tab.1 Results from two-way ANOVA exam ining effects of oyster shell and biofilm on the densities of settled oysters

图1 2019年室内实验（A）和野外实验（B）中新壳和旧壳上牡蛎附着量Fig.1 Settled oyster densities on the fresh and old oyster shells in the lab（A）and field（B）experiments of 2019

在2020年野外附着实验中，牡蛎壳对藤壶附着量没有显著影响（表2，P＞0.05），而潮区显著影响着藤壶附着量（表2，P＜0.05），2个因子之间没有显著的交互作用（表2，P＞0.05）。仅在0.6 m潮区、15 d时藤壶附着量的大小顺序为：新壳＞旧壳（图3-A，P＜0.05）；而在其他试验组中，新、旧壳上藤壶附着量的差异均不显著（图3，P＞0.05）。在每个潮区中，藤壶附着量的时间变化均呈现为：45 d和70 d均显著高于15 d（图3，P＜0.05）。

表2 牡蛎壳和潮区对牡蛎和藤壶附着量影响的二维方差分析结果Tab.2 Results from two-way ANOVA exam ining the effects of oyster shell and tidal zone on the densities of settled oysters and barnacles

图2 2020年野外实验中新壳和旧壳上牡蛎附着量Fig.2 Settled oyster densities on the fresh and old oyster shells in the field experiment of 2020

图3 2020年野外实验中新壳和旧壳上藤壶附着量Fig.3 Settled barnacle densities on the fresh and old oyster shells in the field experiment of 2020

在2020年野外附着实验中，牡蛎壳和潮区对附着牡蛎壳高的影响均不显著（表3，P＞0.05），2个因子之间没有显著的交互作用（表3，P＞0.05）。所有试验组中，新、旧牡蛎壳附着牡蛎壳高均无显著差异（图4，P＞0.05）；在每个潮区中，附着牡蛎壳高的时间变化均呈现为：45 d和70 d显著高于15 d（图4，P＜0.05）。

3 讨论

合适的底物是吸引牡蛎幼虫附着和成功修复牡蛎礁的关键因素之一［6，9-10］。牡蛎壳因其表面结构粗糙，壳内含丰富钙元素，同时其复杂的三维结构降低了牡蛎幼虫在附着时受到水流因素的干扰，为浮游幼虫的成功附着创造了有利条件［11-12］。PRESTON等［13］发现，在新的同种牡蛎壳上欧洲牡蛎（Ostreaedulis）稚贝附着量显著高于旧壳。LOPES［14］研究发现，腐蚀严重的牡蛎壳上附着生物十分稀少。2019年野外实验（对照组）和2020年野外实验结果均发现，新壳上的牡蛎附着量显著高于旧壳，验证了新壳对牡蛎幼虫附着的诱导能力显著大于旧壳这一假设。而且这两种牡蛎壳对牡蛎幼虫附着的吸引力也受到生物膜的影响，如2019年室内实验中生物膜处理下两种牡蛎壳间牡蛎附着量存在显著差异。新、旧壳是自然牡蛎礁体上常见的两种壳型，牡蛎死亡后其硬壳部分不会迅速降解，在很长一段时间内会继续保留在礁体上，充当牡蛎幼虫的附着底物［15］。但由于长期遭受生物与非生物因素侵蚀，旧壳的外观结构与内部成分都发生了改变，如牡蛎壳表面变得光滑、壳内钙素流失，不再含有新壳中残存的牡蛎分泌物成分，从而导致旧壳的附苗效果逐步下降［16-17］。但本研究也发现，藤壶在新、旧壳上附着量没有差异，表明藤壶幼虫对新、旧壳并未表现出明显的附着偏好。

表3 牡蛎壳和潮区对附着牡蛎壳高影响的二维方差分析结果Tab.3 Results from two-way ANOVA exam ining the effects of oyster shell and tidal zone on the shell height of settled oysters

图4 2020年野外实验中新壳和旧壳上附着牡蛎的平均壳高Fig.4 Shell height of settled oysters on the fresh and old oyster shells in the field experiments of 2020

生物膜能够对包括牡蛎在内的多种海洋无脊椎动物的附着行为产生显著的诱导效应［18-20］，主要通过释放与成年牡蛎相似的化学信号，用以指示最佳栖息位点，从而诱导浮游幼虫 附 着 变 态［19］。RODRIGUEZ-PEREZ等［11］发现，生物膜能明显诱导欧洲牡蛎幼虫附着，附着效率会随着时间的延长而提高。本研究的室内实验结果显示，生物膜显著提高新壳的附苗效率，但不影响旧壳的附苗效率；而在野外实验中得出的结果完全相反，生物膜显著提高旧牡蛎的附苗效率，但对新壳的附苗效率没有影响。这种结果可能与实验周期和两种牡蛎壳上生物膜生长差异有关。相较于旧壳，新壳上生物膜发育得更好，能在短期（室内实验附苗周期为3 d）内快速提升新壳的附苗效率，但在较长周期（野外实验附苗周期约40 d）内随着牡蛎附着量的逐步增加其效果会下降；而在旧壳上生物膜发育得相对较差，短期内对旧壳的附苗效率影响有限，但在较长周期内其对附苗效率的累积影响是明显的。

潮区是影响牡蛎附着的关键因子之一，附着潮区过低或过高都不利于牡蛎幼虫的附着、生长与存活［21-23］。已有研究结果表明，不同种类牡蛎偏好附着于不同的潮区，发育后期的浮游幼虫通常会垂直向下迁移寻找最适的附着位点［21-24］。本研究发现，潮区对两种牡蛎壳上牡蛎附着量的影响并不显著，可能是由于两个实验潮区的高度间隔较小，浮游幼虫的垂直附着差异并不明显。在同一潮区中，两种牡蛎壳间附着稚贝的壳高未见显著性差异，可以初步确定这两种牡蛎壳并不会对稚贝的生长速率起决定性的诱导或抑制作用。

本研究发现，新壳的附苗效果总体好于旧壳，而且这种差异涵盖了整个牡蛎繁殖、附着及补充高峰期。因此在牡蛎礁修复中应优先选取新壳作为底物，尤其在牡蛎幼虫丰度较低的环境中。未来需进一步从壳表化学组成及微结构等方面阐明两种牡蛎壳间附苗效果差异的原因及机理。