基于线粒体COⅠ基因序列的中国沿海缘边银鲈遗传多样性分析

张玉宁，章 群，黄柏炎，宫亚运，罗 纯，黄志基

（暨南大学生命科学技术学院，广州 510632）

缘边银鲈（GerreslimbatusCuvier，1830）隶属于鲈形目（Perciformes）银鲈科（Gerreidae）银鲈属，主要分布于印度洋西部、北部至西太平洋的东南亚海域及中国南海、东海等海域［1］，栖息于河口、红树林地带等近海海岸和浅海区。短棘银鲈（G.lucidus）为缘边银鲈的同物异名，有研究认为前者为后者的幼年状态［2］。缘边银鲈体长通常不超过15 cm，是小型经济鱼类，肉质鲜美，营养丰富，具有一定的资源开发和利用价值。缘边银鲈是低等捕食者，主要摄食底栖生物［3］，也是上层猎食者的食物，在食物链的关系中处于中下水平的位置，在近海生态系统中具有重要作用。近年来由于海洋环境恶化和过度捕捞等原因［4-5］，缘边银鲈逐渐成为近海渔获中的偶见物种，其群体资源量和遗传特性的状况，也可以在一定程度上间接反映近海渔业资源量的动态变化。

研究中国沿海缘边银鲈种群遗传背景，有利于了解其种群的资源现状，并可为其种质遗传资源的保护和开发利用提供科学依据。目前国内外对缘边银鲈的研究主要涉及资源状况、生长发育、形态比较区分、新种分布等方面［6-8］，国内尚未见对于缘边银鲈遗传背景的研究。动物线粒体DNA属母系遗传，拷贝数多，无组织特异性，具有闭合环状相对稳定的基因结构，不易降解，成为动物种群遗传研究的首选分子标记［9］。其中，细胞色素氧化酶Ⅰ（cytochrome oxidase subunitⅠ，COⅠ）5′约652 bp序列已广泛应用于动物种类鉴定的DNA条形码研究中［10］。目前国内外建立了FishBol（http：／／www.fishbol.org／）等大型数据库，为开展相关物种的种群遗传学研究提供了大量数据可兹利用。近年来，国内外有不少研究同样利用COⅠ基因来研究鱼类遗传多样性状况的报道，如褐篮子鱼（Siganusfuscescens）［11］、多鳞四指马（Eleutheronemarhadinum）［12］、星点东方鲀（Takifuguniphobles）［13］等。本研究基于线粒体COⅠ基因片段序列对中国东南沿海多个缘边银鲈群体进行遗传学分析，探究该物种群体分布区的遗传多样性状况，以期为物种保护和遗传状况评估提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

实验材料采自中国东南沿海4省9个地理群体，鉴定后以95%乙醇溶液保存备用。测定的样本包括广西东兴（GDX）13尾、合浦（GHP）15尾，海南新盈（QXY）14尾，广东安铺（YAP）25尾、硇洲岛（YNZ）8尾、阳江（YYJ）22尾、碣石（YJS）19尾，福建福清（MFQ）7尾、宁德（MND）12尾共4省9个群体135尾缘边银鲈COⅠ基因序列。结合GenBank下 载 的 广 东 阳 江（EF607388、EF607392）、福建福清（KY315350、KY315355、KY315357）等序列，总共分析了9个地理群体的140条COⅠ基因序列。缘边银鲈采样地点分布见图1所示。

图1 缘边银鲈采样点分布图（仿自孙湘平［14］）Fig.1 Sampling sites of G.limbatus（adopted from SUN Xiangping［14］）

1.2 DNA提取与PCR扩增

取适量标本鱼体背部肌肉，经蛋白酶K消化完全后，采取酚-仿法提取DNA［15］。PCR反应体系和扩增条件参考WARD等［10］的实验方法。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测电泳条带，确认得到预期PCR扩增产物后，送华大基因测序公司纯化测序。

1.3 数据处理

测序所得序列使用Bioedit 7.0.9.0进行人工校对和多序列比对。利用MEGA 7.0计算核苷酸组分占比、碱基变异值、转换颠换值，统计突变位点数。采用DnaSP 6.12.03软件计算单倍型数、单倍型多样性（haplotype diversity，Hd）、核苷酸多样性（nucleotide diversity，π）、核酸不配对分析（mismatch distribution）。采用Network 5.0构建单倍型网络图。以Arlequin 3.5.2.2估算遗传分化系数（Fst）和群体间基因流的值（Nm）；通过分子方差分析（analysis of molecular variation，AMOVA）分析遗传变异分布情况，以1 000次置换分析统计学显著性；计算Tajima'sD和Fu'sFs值并进行中性检验，得到方差值（sum of square deviations，SSD）、参差指数r值（Harpending's raggedness index，Rg）、τ值参数。结合中性检验和核酸不配对分析检测种群历史动态。根据公式“T＝（τ／2μk）×世代时间”计算种群扩张时间。其中，T是种群扩张时间；τ是种群扩张时间参数；μ是序列的变异速率；k是序列长度。

2 结果与分析

2.1 COⅠ基因片段序列特征和遗传多样性

在140条缘边银鲈COⅠ基因5′端652 bp序列中，T、C、A和G含量分别为28.7%、30.7%、22.7%和17.9%。A＋T含量（51.4%）略高于C＋G含量（48.6%），碱基组成显示一定的偏倚性，与其他鱼类的COⅠ碱基含量分布特性相似［10］。发现变异位点14个，简约信息位点6个，单倍型13个。转换和颠换比（Ts／Tv）为4.0，表明序列进化还未趋于饱和，适用于进行种群遗传分析［16］。缘边银鲈整体的单倍型多样性指数（Hd＝0.276±0.050）和核苷酸多样性（π＝0.000 5±0.000 1）都相对较低。其中单倍型多样性最高的是碣石群体（Hd＝0.456），其次是宁德群体（Hd＝0.439）。核苷酸多样性最高的是硇洲群体（π＝0.001 1），其次是宁德群体（π＝0.001 0）。合浦群体和新盈群体遗传多样性指数均呈现最低（Hd＝0，π＝0）。以琼州海峡为界，北部湾沿海的广西东兴与合浦与广东安铺和海南新盈群体遗传多样性普遍低下（Hd＜0.300，π≤0.000 5）；而琼州海峡以东广东至福建沿海群体的遗传多样性则相对较高（Hd＞0.300，π≥0.000 6）。各群体的遗传多样性指数详见表1。

2.2 缘边银鲈遗传分化

140条COⅠ序列中总共检测到13个单倍型。其中单倍型Hap_1数量最多（119条），其他单倍型数量较少，单倍型内的个数均不超过6个。Hap_1为所有群体共享，Hap_3为东兴、碣石、福清和宁德群体共享，Hap_4为安铺和碣石群体共享，Hap_8为阳江、碣石群体共享，其余单倍型分布于各群体。除新盈和合浦群体仅含共享单倍型Hap_1外，其他群体都拥有几个独有的单倍型。

单倍型最大简约性网络图为典型的星状放射结构，没有明显的地理聚群和谱系结构（图2）。主体单倍型Hap_1（占比85.00%，119／140）位于网络中心，其他单倍型由此衍生，表明缘边银鲈群体经过历史上的种群扩张。

群体间遗传分化（Fst＝-0.041 5～0.169 6，P＞0.05）详见表2。其中，硇洲群体与其他群体间为不显著的中低度分化（0.077 3～0.169 6）。宁德群体和合浦群体、新盈群体的Fst值分别为0.061 2和0.054 2，也表现为不显著的低度分化。其他各群体间的Fst值为-0.041 5～0.044 6，不存在明显分化。

表1 缘边银鲈的遗传多样性指数Tab.1 Genetic diversity of G.limbatus

图2 缘边银鲈单倍型网络图Fig.2 Parsimony network of G.limbatus haplotypes

将9个群体依照海区位置，通过3种不同方式进行AMOVA分析：①9个地理群体；②北部湾群组（东兴、合浦、新盈、安铺）、广东群组（硇洲、阳江、碣石）、福建群组（福清、宁德）；③海岛群组（硇洲、新盈）、大陆群组（东兴、合浦、安铺、阳江、碣石、福清、宁德）。AMOVA分析（表3）表明3种分组方式的主要变异均发生在群体内，群体间的差异来源非常小，而群体内的变异来源比例达到95%以上，变异比例分别为97.17%、96.95%、95.81%。同时3种分组方法下3种群组间的Fst值为0.028 3～0.041 9，说明群组间无明显分化（0.05＜Fst＜0.15，0.01＜P＜0.05）。

表2 缘边银鲈群体的遗传分化系数（F st）Tab.2 F st among G.limbatus populations

表3 缘边银鲈种群结构的分子方差分析Tab.3 Analysis ofmolecular variation（AMOVA）among populations of G.limbatus

2.3 缘边银鲈种群历史动态

中性检验结果见表4。在Tajima'sD结果中，除合浦、新盈、硇洲群体外，安铺、阳江、福清群体为显著性负值（-1.987 3～-1.400 9，P＜0.05），其他群体为不显著性负值。在Fu'sFs结果中，东兴、安铺、阳江、碣石、福清5个群体为显著性负值（-3.143 5～-1.163 9，P＜0.05）。9个群体整体的Tajima'sD＝-2.254 9、Fu'sFs＝-16.472 5，均为显著性负值，呈现出群体扩张迹象。群体整体SSD值及Rg值数值均较小且不具统计显著性（P＞0.05），表明上述观测值没有显著偏离扩张模型。Fu'sFs检验比Tajima'sD检验对近期群体扩张更为敏感，且群体整体核苷酸错配图（图3）呈现出明显单峰，加上单倍型网络图为典型的星型结构，说明其种群在历史上经历过快速扩张事件［17-18］。缘边银鲈样本群体总体扩张参数τ为0.566 7，参考WANG等［19］，以COⅠ基因进化速率为每百万年1%～3%计算，参考同属长棘银鲈（G.filamentosus）生长特性［20］，以性成熟期3年为参数，估算种群扩张时期大约为距今0.130 4～0.043 5百万年，地质史上处于晚更新世时期。

3 讨论

3.1 缘边银鲈种群历史动态

当单倍型多样性Hd小于0.5、核酸多样性π小于0.005时，表示种群近期可能经历过瓶颈效应［21］。缘边银鲈COⅠ序列遗传多样性水平（Hd＝0.276±0.050，π＝0.000 5±0.000 1）远低于上述标准，表明中国沿海缘边银鲈种群近期经历过瓶颈效应。根据中性检验的Tajima'sD检验法重点关注较长跨度时间范围内所发生的扩张事件；而Fu'sFs检验法则更侧重反映种群近期的扩张事件，当种群在近期积累较多突变时，Fs往往是较大的负值［22］。缘边银鲈总体Tajima'sD（-2.254 9，P＜0.01）和Fu'sFs值（-16.472 5，P＜0.01）均为显著性负值；同时缘边银鲈13种单倍型中各群体的共享单倍型Hap_1占比达到85.00%，单倍型网络图呈现明显的星状结构［23］；另外核苷酸错配图为明显单峰；表明缘边银鲈在历史上经历过种群扩张事件。根据中性溯祖理论，估算缘边银鲈种群扩张时期大约发生在距今0.130 4～0.043 5百万年。这一地质时期的北半球历经冰期／间冰期的交替变化［24］，海平面升降变动，大部分近海鱼类因此交替发生瓶颈效应与种群的快速扩张［25］。冰盛期北部湾大陆架出露，缘边银鲈种群生存空间被迫压缩至琼州海峡以东的边缘海，出现瓶颈效应；间冰期海平面上升，缘边银鲈群体出现种群的快速扩张。

图3 缘边银鲈群体整体核苷酸错配图Fig.3 Nucleotidem ismatch distribution of G.limbatus haplotypes

表4 缘边银鲈中性检验和不对称分析Tab.4 Neutrality tests and m ism atch analysis of G.limbatus

3.2 缘边银鲈遗传多样性与遗传分化

物种遗传多样性模式受其进化历史影响。与同海域的长棘银鲈（Hd＝0.767±0.018，π＝0.005 5±0.003 7）［26］、多鳞四指马（Hd＝0.759±0.035，π＝0.001 98±0.003 26）［12］、鲻（Mugilcephalus）（Hd＝0.956，π＝0.027 9）［27］等鱼类的遗传多样性相比，缘边银鲈遗传多样性明显偏低。由于缘边银鲈在河口、内湾的潮汐带和非常浅的海区栖息，易受近海污染、栖息地破坏、过度捕捞等制约因素的影响，在一定程度上也导致了遗传多样性的进一步降低。与栖息于深层水域的鱼类相比，更新世以来的冰期和间冰期交替变化所造成的海平面升降波动，更容易使生活于近海浅海区的缘边银鲈面临瓶颈效应的胁迫。

缘边银鲈群体间Fst为-0.041 5～0.169 6（P＞0.05）。AMOVA分析结果显示遗传变异主要来源于群体内个体间的分化，几种不同分组方式下的群体内的变异来源比例均达到95%以上，表明中国沿海的缘边银鲈为一个随机交配种群。由于有研究认为琼州海峡形成于全新世中期的海侵，在地质史上形成年代较晚［28］，据此推测缘边银鲈主群体方扩张至北部湾海区时间短，以致群体间遗传分化不明显；东兴、合浦、安铺、新盈等4个边缘群体，没有足够时间积累遗传变异，遗传多样性明显低于琼州海峡以东群体。

3.3 缘边银鲈种群资源保护

缘边银鲈栖息于近岸海域，其生境生态受沿海地区环境变动和人类活动的影响较大。由于海洋环境恶化，海岸污染持续［4］，加上长期以来近海捕捞压力的增大，许多渔业资源总体上是退化的［5］。缘边银鲈遗传多样性不高，群体数量不多，其种群资源亟需保护。本研究中，缘边银鲈各地理群体间的分化程度较低，可以将其看作一个进化显著单位。而宁德群体的单倍型多样性和核苷酸多样性都相对较高，此外硇洲群体与其他群体的遗传分化系数较大且其核苷酸多样性最高，均可作为优先管理保护单位。北部湾群体整体上的遗传多样性最低，应重视对其群体资源的保护。由于本研究所选取的COⅠ序列片段中的基因变异程度低，推测其变异速率不够高，同时受采集地点及样本数量的限制，在今后的研究中，可以采用测序线粒体控制区，基于微卫星标记或简化基因组等方法分析更多大样本的地理群体，深入了解缘边银鲈遗传背景，以更好地为中国缘边银鲈的种质资源保护和开发利用提供更多的理论科学依据。