中国鲎消化道发育组织学观察

鲍虞园，叶国玲，李银康，谢木娇，蓝军南，颉晓勇

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广州 510300；2.上海海洋大学，水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，水产科学国家级实验教学示范中心，上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306）

中国鲎（Tachypleustridentatus），隶属于肢口纲（Merostomata），剑 尾 目（Xiphosura），鲎 科（Limulidae），东方鲎属，因头胸部具有发达的马蹄形背甲，故又被称为马蹄蟹。鲎主要生活在浅海沙质海底，喜栖息于盐度较低的河口，同时具有溯河而上的习性［1］。其主要分布于中国东南沿海、日本以及东南亚等地［2］。鲎为典型的杂食性动物，其自然饵料涵盖面极广且混杂，尤其喜爱摄食海洋浮游植物、微藻类及底栖无脊椎动物［3-4］。鲎在医药、科研、民俗文化及沿海生态保护等方面为人类提供了极为重要的利用价值，但随着经济的快速发展，鲎的栖息地环境遭受污染、破坏甚至消失，使其种群资源大量衰退，中国鲎更是岌岌可危［5］。中国大陆已将鲎列入“名贵珍稀水生动物”，中国香港也将其列入保护项目［6］，2019年3月，世界自然保护联盟（IUCN）正式将中国鲎在IUCN红色名录中的等级从原本的数据缺乏（data deficiencies）更新为濒危（endangered）。因此鲎资源的保护与恢复已迫在眉睫，而人工育苗和人工增殖放流是恢复鲎资源种群数量行之有效的措施之一［7］。

消化系统是动物对食物进行消化、吸收、排出的主要场所，是动物新陈代谢的基本保证，直接关系到动物的生长和发育。研究水产动物消化系统的发育过程有助于人们从根本上了解不同时期幼体消化系统的完善程度，从而在育苗生产中能准确掌握苗种开口期的饵料需求，这对养殖及饵料营养等方面的研究具有重要的现实意义。相关研究在国内外已有不少报道，研究对象主要集中在鱼类［8-12］、虾［13-14］、蟹［15-16］等经济型水产动物。消化道是消化系统的主要组成部分，观察消化道组织的发育是了解其摄食、消化及吸收营养物质过程机制的主要途径，在鱼类、甲壳类及较低等的环节动物等均有较多的研究［17-22］。然而国内关于鲎的消化道组织学研究较少见，吕林兰和董学兴［23］和刘正琮等［24］分别对圆尾鲎（Carcinoscorpiusrotundicauda）和中国鲎的消化道组织结构进行了观察，谢木娇等［25］对圆尾鲎消化道粘液细胞分布进行了研究，陈秀荔［26］和刘伟茹［27］对圆尾鲎和中国鲎消化道进行了组织学比较分析。而关于中国鲎消化道发育过程的组织学研究在国内外更是鲜见报道。研究表明，目前鲎的消化道划分尚无统一的标准［26］，本文参考洪水根［28］的划分方法将中国鲎的消化道划分为食道、胃、中肠、直肠等几大部分，采用石蜡连续切片和H-E染色技术，对15日龄～2龄及成年中国鲎的消化道发育过程进行组织学观察，初步探讨其结构与功能的关系，以期为后续中国鲎幼体消化生理、生化方面的研究奠定基础，也为苗种科学管理和营养饲料的合理选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用中国鲎均来自广东省湛江市中国水产科学研究院南海水产研究所中国鲎研究基地。

1.2 实验方法

2018年5—9月在广东湛江对中国鲎进行人工繁育技术研究［17］。在水温28～32℃、盐度26～30、pH 7.4～7.8的条件下，受精卵经历约45 d胚胎发育孵化成1龄稚鲎，又经约90 d发育蜕壳进入2龄。从孵化后第1天开始，直至1龄稚鲎蜕壳进入2龄，每天取稚鲎10尾；成年个体解剖取出消化道，分离食道、胃、中肠和直肠。样品置于4%多聚甲醛中固定24 h后，转入70%的乙醇中保存。将固定好的样品流水冲洗12 h，经50%～100%梯度乙醇脱水（50%乙醇2 h、70%乙醇4 h、80%乙醇2 h、85%乙醇2 h、95%乙醇45 min×2、100%乙醇45 min×2），二甲苯透明（1／2无水乙醇＋1／2二甲苯混合液1 h、二甲苯15 min×2），浸蜡（石蜡2 h×2），石蜡包埋，以4～6μm的厚度进行纵向连续切片，苏木精-伊红（H-E）染色，中性树脂封片，在ZEISS Axio Scope.A1型光学显微镜下观察并摄影记录。

2 结果与分析

2.1 食道

15日龄，食道壁仅见黏膜层和黏膜下层，肌层与浆膜尚未形成。黏膜层和黏膜下层形成2～3个较宽大的黏膜皱褶向腔面突起，食道腔较小。黏膜层为单层柱状上皮，上皮细胞高柱状，界限模糊，顶部着色较浅，核基位，深染，此时尚未有几丁质层形成，亦未见有纤毛。黏膜下层与疏松结缔组织交替，界限不清晰，其中有零星肌纤维及游走细胞分布（图版Ⅰ-A）。26日龄，食道腔稍有增大，黏膜皱褶仍为2～3个，黏膜层呈紫红色，细胞界限模糊，黏膜上皮顶层着色加深且形成一深色条带，疑似纤毛层或初期的几丁质层。黏膜下层与疏松结缔组织界限仍未区分，但其中肌纤维开始延伸（图版Ⅰ-B）。至60日龄，食道腔明显增大，黏膜皱褶增加至4～5个。黏膜上皮细胞的细胞核开始清晰，基位，深染，上皮细胞顶部出现纤毛，形成浅红色的纹状缘。黏膜下层与疏松结缔组织界限开始逐渐形成，其之间的肌纤维数量增加，形成肌纤维环及其他单体肌纤维束，趋向于形成肌肉层（图版Ⅰ-C）。

2龄，食道直径及其内腔均明显较前期大，黏膜皱褶增加至9～12个，其中大皱褶为6～7个，小皱褶为4～5个，大皱褶靠近顶部有分叉。黏膜层的上皮细胞界限不清晰，但其细胞核较清晰，呈紫红色，基位。黏膜上皮顶部的纹状缘消失，开始形成一小薄层几丁质层，呈粉红色。黏膜层和黏膜下层开始区分。肌肉层开始出现，由8～10个肌纤维束环组成，其细胞核深染，结构清晰，肌纤维束环之间有少数结缔组织分布，两者共同形成肌肉层。肌肉层外形成有结缔组织薄膜组成的浆膜层，与周围疏松结缔组织区分明显。此时食道的组织结构基本发育完善（图版Ⅰ-D）。

成年中国鲎，食道可解剖分解，上端为口，下端与前胃相连。其组织结构由内到外由几丁质层、黏膜层、黏膜下层、肌肉层及浆膜5层结构组成。各层结构完整且区分明显。黏膜皱褶高度和宽度均较前期大，10～12个，多为分叉，往腔面突起几乎充满整个内腔。几丁质明显较前期厚，往黏膜层延伸，靠腔面一侧形成染色较深的外缘带。肌肉层紧密且较厚，其间的结缔组织较少（图版Ⅰ-E）。

2.2 胃

15日龄，胃壁的黏膜层和黏膜下层尚未区分明显，共同向胃腔突起形成6～8个黏膜皱褶，皱褶较矮，胃腔较大。黏膜层为单层柱状上皮，细胞矮柱状，核基位，呈紫红色。黏膜下层与肌肉层亦尚未区分，肌肉层仅有3～5个肌纤维环及大量结缔组织组成。浆膜由结缔组织及间皮细胞组成，外与疏松结缔组织相连（图版Ⅰ-F）。26日龄，胃壁黏膜层的上皮细胞呈高柱状，核基位，嗜碱性增强，着色加深，细胞顶部形成深染的外缘，或将发育形成几丁质层。黏膜皱褶增高，呈波浪形排列。肌肉层的肌纤维增加，形成数个环形肌束，其中仍有较多的结缔组织分布。浆膜着色加深，与周围疏松结缔组织开始区分明显（图版Ⅰ-G）。至60日龄，胃壁黏膜上皮细胞嗜碱性增加，呈深紫色，细胞顶部深染外缘扩大且着色加深，形成纤毛状向腔面游离。黏膜皱褶高度变化不明显。肌肉层的肌束增加，红染区域增大。浆膜层的间皮细胞嗜碱性增强，核深染（图版Ⅰ-H）。

2龄，胃壁黏膜皱褶迅速增高，有13～15个，往腔面呈指状突起，其顶部已形成较厚的几丁质层。黏膜上皮细胞高柱状，核较大，基位，呈深紫色；肌肉层增厚，为环肌，结缔组织减少；浆膜与周围结缔组织界限明显；此时胃组织结构基本形成（图版Ⅰ-I，J）。

成年个体，胃的解剖结构可分为前胃和幽门。前胃黏膜皱褶呈波浪形向胃腔突起，顶部呈指状或钟形，有14～16个，其几丁质层较厚。黏膜下层有放射肌，肌肉层发达，厚度明显较前期厚（图版Ⅰ-K）。幽门部由幽门内壁、幽门外壁及肠壁组成，前端连接前胃，后端深入肠腔形成一套叠结构，均有波浪形或锯齿状的黏膜皱褶向幽门腔和肠腔突起（图版Ⅰ-L）。此为发育完全的胃组织结构。

2.3 中肠

15日龄，中肠壁黏膜层与黏膜尚未区分，有6～8个黏膜皱褶向中肠腔突起。黏膜层为单层柱状上皮，细胞呈矮柱状，核基位，细胞顶部边缘着色较深，或将发育形成纹状缘。肌肉层尚未形成，仅有1～2个肌纤维束环及结缔组织形成。浆膜与周围疏松结缔组织尚未区分明显（图版Ⅱ-A）。30日龄，中肠壁黏膜层与黏膜下层界限不明显，黏膜上皮顶部形成粉红色的纹状缘；黏膜皱褶高度增高，向中肠腔延伸。肌肉层的肌纤维束增厚，还有其他肌纤维及结缔组织。浆膜层着色较深，与周围疏松结缔组织开始区分（图版Ⅱ-B）。70日龄时，中肠壁组织结构清晰，黏膜皱褶高度增高，有9～11个，向肠腔延伸，上皮细胞嗜碱性增强，细胞界限不清晰，核基位，纹状缘着色加深。肌肉层为肌纤维束环，浆膜为结缔组织及间皮细胞组成，着色加深（图版Ⅱ-C）。

2龄，中肠壁各层组织结构已区分明显，黏膜皱褶几乎充满肠腔，纹状缘明显增厚，未见有几丁质层结构形成。肌肉层增厚，多为环肌。浆膜与周围疏松结缔组织分离（图版Ⅱ-D）。

成年个体，中肠壁完整结构由黏膜层、黏膜下层、肌肉层和浆膜组成（图版Ⅱ-E）。黏膜上皮顶部为较厚的纹状缘，无几丁质层包裹。黏膜皱褶宽大，多为分叉，形成锯齿状。黏膜上皮细胞高柱状，核基位，顶部为粉红色纹状缘，上皮底部为深红色的基带与黏膜下层隔开。黏膜下层与肌肉层界限不清晰。环肌和纵肌及结缔组织交错。浆膜为间皮和结缔组织（图版Ⅱ-F）。此为发育完全的中肠壁组织结构。

2.4 直肠

15日龄，直肠壁各层结构尚未区分，仅见较厚黏膜层，向肠腔形成波浪形皱褶，肠腔较小。黏膜层外仅有一侧有少量肌纤维形成；浆膜层与周围结缔组织尚未区分（图版Ⅱ-G）。30日龄，直肠直径增大，黏膜皱褶4～5个，黏膜上皮嗜碱性增强，上皮细胞矮柱状，核基位，顶部形成粉红色纹状缘。黏膜下层与肌肉层尚未区分，肌纤维增加形成肌纤维束环。浆膜与周围疏松结缔组织界限不清晰（图版Ⅱ-H）。至70日龄，直肠壁黏膜层嗜碱性增强，上皮顶部的纹状缘着色加深；黏膜下层与肌肉层仍未明显区分；肌肉层肌纤维束增厚；浆膜层有一侧与周围疏松结缔组织分离（图版Ⅱ-I）。

2龄，直肠直径明显增大，直肠壁由黏膜层、黏膜下层、肌肉层及浆膜组成。黏膜皱褶10～12个，呈指状向腔面突起；黏膜上皮顶部几丁质层发育形成，多有分叉，呈锯齿状包裹黏膜上皮。黏膜下层与肌肉层界限不明显，肌肉层增厚，由肌纤维束及结缔组织形成。浆膜明显，由间皮和结缔组织形成，与周围结缔组织分离（图版Ⅱ-J）。此时，直肠各层组织结构基本发育完成。

成年个体，直肠可解剖分离，直径较大。直肠壁几丁质层、黏膜层、黏膜下层、肌肉层及浆膜均明显较前期厚。几丁质层较厚，多有锯齿状突起，其下为深染的条带与黏膜层隔开。黏膜皱褶为波浪形，有10～15个大型皱褶，各大型皱褶上分多个次级皱褶。黏膜上皮细胞矮柱状，核基位，嗜碱性较强。黏膜下层分布有较多大小不一的放射肌。肌肉层厚，内层为不连续环肌，外层为纵肌。浆膜亦增厚，由间皮及结缔组织组成（图版Ⅱ-K，L）。此为发育完全的直肠结构。

3 讨论

3.1 中国鲎消化道发育的组织学特征

中国鲎消化道组织结构的发育过程呈现逐渐复杂的规律。15日龄，消化道各段组织结构基本类似，黏膜层最早形成，黏膜层是黏液腺及黏液细胞分布的主要部位［29］，其主要功能是分泌黏液，在保护润滑、消化吸收、免疫防御、离子转运等方面具有重要作用［30-32］。黏膜层的形成，为食物的消化吸收提供了基本可能，黏膜上皮由多种不同的细胞组成，包括柱状细胞、内分泌细胞、黏液细胞，这些细胞的分泌物起到润滑作用并参与了消化过程。此时，黏膜层与黏膜下层向消化道内腔凸起形成较矮的黏膜皱褶，扩大了消化道与食物的接触面积，以便提高消化能力。肌层尚未形成，说明此时稚鲎的消化道收缩能力较弱，其摄食能力较弱或尚未开始摄食。26日龄，食道和胃的黏膜上皮顶部出现深染条带，根据刘正琮等［24］对中国鲎消化道的研究，该条带可能是几丁质层或纹状缘的早期阶段。30日龄，中肠和后肠的黏膜上皮顶部形成粉红的纹状缘，纹状缘为发达的微绒毛，可进一步加大吸收面积［26］；消化道各段肌纤维数量增加，其收缩能力增强。60日龄，消化道黏膜皱褶明显增高，肌肉层形成；食道和胃黏膜上皮顶部深色条带发育成纹状缘，至70日龄，中肠和直肠的纹状缘着色加深，表明其消化功能逐渐增强。到2龄，中国鲎消化道组织由黏膜层、黏膜下层、肌肉层及浆膜组成，各层区分明显。其中，食道、胃和直肠的黏膜上皮顶部有几丁质层包裹，而中肠黏膜上皮顶部为纹状缘，这与刘正琮等［24］和陈秀荔等［26］对成年中国鲎消化道的研究结果基本一致，表明2龄中国鲎的消化道组织结构基本完善，具备基本的摄食及消化能力。成年中国鲎消化道可在解剖学上划分为食道、胃（前胃和幽门）、中肠和直肠等部分，在组织学上各部分可明显区分，食道、胃和直肠的几丁质层均明显比2龄时要厚，黏膜皱褶和肌肉层十分发达，其中黏膜下层有较多的放射肌分布，该结果与其他学者的结果基本一致，这是与其消化功能相适应的体现［23-24，26］。

3.2 中国鲎消化道组织结构发育与摄食的关系

鲎为杂食性动物，其自然饵料十分复杂［26］。ELZINGA［33］运用稳定同位素标记的方法对鲎的食性进行研究，结果表明较小龄期的幼鲎主要依赖腐屑及粘附在基底质上的有机微粒为主要饵料，随着年龄的增长逐渐过渡为多毛类及甲壳类，成鲎则以更大的双壳类及腹足类为食。另外，圆尾鲎及中国鲎幼体也喜食昆虫幼虫、小型多毛类等小型食物［34］。而陈秀荔等［26］和刘伟茹［27］通过对中国鲎和圆尾鲎消化道外部形态观察、形态测量、组织切片观察及形态指数的定量分析，表明中国鲎与圆尾鲎消化道形态组织结构与其杂食性密切相关。本研究结果显示，1龄稚鲎消化道组织发育较为缓慢，组织结构尚未完善，肌肉层尚不发达，食道和胃的几丁质层尚未形成，并不具备摄食和消化大型饵料的能力，因此推测正处于消化道发育初期阶段的1龄稚鲎主要消耗内源性营养，尚未开始摄食或仅摄食少量腐屑或有机微粒来加强消化道的发育。有研究显示，将1龄稚鲎置于高密度饵料的水体中饲养，并未观察到其进食，由此推测1龄稚鲎并未开始摄食，仅由卵黄提供营养［35］。2龄幼鲎的消化道发育基本完善，与成鲎的组织结构基本类似，其食道的几丁质层和肌肉层开始形成，为摄食和消化提供了可能，几丁质层可保护食道不被食物损伤，肌肉层的形成增加了食道的收缩能力，有助于将食物向胃推进，加上发达的黏膜皱褶，增加食物与消化道的接触面，可暂时容纳食物，使之与黏液充分接触，更利于食物的推进；胃发达的黏膜皱褶及其表面的几丁质层以及发达的肌肉层可有效研磨食物，使之免受损伤；中肠形成发达黏膜皱褶和微绒毛，增加了吸收面积，符合消化吸收主要场所的典型特点；直肠发达的黏膜皱褶便于食物残渣中的水分和无机盐回收利用，从而调节血液的渗透压和离子平衡，几丁质层可使直肠壁在残渣向肛门推移的过程中免受损伤［26-27，36-37］。中国鲎2龄个体消化道组织结构特点表明该时期开始具备摄食及消化的能力，此阶段应是幼鲎开始摄食的关键时期。此外，对中国鲎摄食规律进行观察研究发现，中国鲎在2龄时开始摄食丰年虫，本研究结果与之相吻合［35］。成年中国鲎消化道的组织结构进一步发育完善，几丁质层及肌肉层显著增厚，黏膜皱褶增高，且黏膜下层出现放射肌，增加了消化道的蠕动和消化吸收功能［35］，喻示成年中国鲎的摄食能力已明显增强，可捕获较大的多毛类和甲壳类作为主要食物［33］，食量也会进一步增加以满足其生长发育的需要。

中国鲎的消化生理研究文献匮乏，如黏液细胞的发育特征及消化酶活性的变化与摄食习性的关系等，亟需进一步多角度开展研究。本研究结果补充了中国鲎的基础生物学内容，可为今后开展其他消化生理学研究、资源开发利用和保护提供理论参考。

图版Ⅱ 中国鲎中肠和直肠的发育PlateⅡ Development ofm idgut and rectum in T.tridentatus