枸杞多糖提取工艺优化及其单糖组成测定

吴佳欣，马 良，陈 腾，李文建，万凤奇，3

1 兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000；2 中国科学院近代物理研究所；3 兰州大学第二医院

枸杞（Lycium barbarumL.）为茄科枸杞属落叶灌木植物，主要分布在我国西北地区，是传统名贵中药材［1-2］。《本草纲目》中记载：“枸杞，补肾生精，养肝，明目，坚精髓，去疲劳，易颜色，变白，明目安神，令人长寿”［3］。枸杞多糖（Lycium barbarumpolysaccharide，LBP）是一种从枸杞子中提取的水溶性多糖，具有多种生物活性，如：提高免疫力［4］，保护视网膜神经［5］，降血糖［6］，抗氧化［7］，保护骨骼［8］等。因此，LBP的研究与开发具有重要的意义。热水提取法是提取多糖常用的方法，近年来相继发展出了酶解提取法、超声助提法、超临界流体萃取法等新方法。与热水提取法相比，这些方法在提取率方面有了一定的提高，但是同时也存在一定弊端［9-10］：酶解提取法提取成本高，且提取条件严格，一般在酸碱环境下提取，增加了工业化生产后废液处理等工序的复杂性；超声提取法的设备价格昂贵，并且长时间的超声提取将导致可溶性多糖降解，其产生的机械效应和空化效应具有较强的破坏性，这可能对多糖的天然构象产生影响甚至破坏其活性中心；超临界流体萃取法等新技术尚处于初步探索阶段，目前还无法实现工业化上大规模的应用。相比之下，热水提取法具有经济、安全的特点，且极大地保留了LBP 的天然构象和活性，不仅适用于工业化生产，还有利于进一步的生物学活性的研究，故本研究选择了热水提取法进行优化。传统优化热水提取条件的方法是固定其他参数，每次只对单一变量进行研究，这种研究方法的效率极低，且无法准确说明不同因素之间的相互作用关系。响应面法采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析寻求最优工艺［11］。相较于传统方法，响应面法的试验周期短，且能够准确可靠地预测最佳工艺条件［12］，目前已广泛应用于食品、化学、农业、生物等领域［13-17］。从枸杞中提取得到的LBP 是一种结构复杂的复合多糖，组成单糖主要有阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖及半乳糖醛酸等［18］，根据枸杞来源的不同，其主要单糖组成种类和比值各不相同［19-20］。HPLC是分析糖类组成的重要方法，通常使用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）在温和条件下与糖进行柱前衍生化反应，使其带上发色基团，从而易被紫外检测器所检测。该法操作便捷、准确度高，目前已被广泛应用于各种糖类化合物的分析［21-22］。

因此，笔者基于甘肃丰富的枸杞资源，采用响应面的方法研究了提取时间、液料比和温度对LBP 提取率的影响，从而对提取条件进行优化。同时，使用柱前衍生化HPLC 法测定LBP 的单糖组成，为LBP的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料枸杞干果（甘肃鼎鑫农业科技有限公司）。甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖（Sigma-Aldrich 公司，批号分别为：WXBC8934V、BCBL0552V、BCBS0769V、BCBV6690、WXBC6480V、WXBC6621V）；乙腈、甲醇（质谱纯，Thermo Fisher 公司）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氟乙酸、PMP、丙酮、三氯甲烷、浓硫酸、苯酚（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；试验用水为超纯水。

1.2 仪器DionexUltiMate 300 型超高效液相色谱仪（Thermo 公司）；N-1100 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；3-5N 型离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）；粉碎机；电热恒温水浴锅。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖的提取 将枸杞干果置于烘箱中60℃干燥12 h 后，进行粉碎，研磨，过筛。称取枸杞粉末10 g，按一定液料比加入蒸馏水，加热提取一定时间后，离心，收集上清液，并将上清液进行抽滤，弃去残渣。将过滤后得到的溶液旋转蒸发，浓缩至50 mL 左右，加入95%乙醇200 mL，于4℃冰箱中静置12 h，抽滤，依次用丙酮、乙醇洗涤2～3次，干燥后得LBP。称质量，计算LBP产率［23］。

1.3.2 单因素试验 选择提取时间、液料比、温度三个因素，以提取产率为衡量指标，进行单因素试验。提取条件为：固定液料比为30∶1，在80℃下分别提取1、2、3、4、5、6、7 h，考察提取时间对LBP提取率的影响；固定提取时间为3 h，以液料比分别为 20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1，在80℃下提取3 h，考察液料比对LBP 提取率的影响；固定液料比为30∶1，分别在60、70、80、85、90、95、100℃下提取3 h，考察温度对LBP 提取率的影响。

1.3.3 响应面设计 在单因素试验的基础上，采用 Design Expert 软件，根据 Box-Benhnken 的原理进行试验设计。在LBP 提取单因素基础上，以提取时间（X1）、液料比（X2）和温度（X3）为自变量，LBP 得率（Y）为响应值，进行3 因素 3 水平的响应面分析。响应面优化回归分析模型为（其中，β0、βi、βii、βij为截距及回归系数，Xi和Xj为自变量）：

1.3.4 LBP 的水解及衍生化 称取10 mg LBP，加入2 mol/L 三氟乙酸5 mL，于烘箱中100℃酸水解3 h。将溶液旋干，加入甲醇洗涤、旋干至中性。将残渣溶于5 mL 水，混匀。移取200 μL 离心管中 ，加入 0.05 mol/L 的 PMP 甲醇溶液 200 μL 和0.3 mol/L NaOH 溶液 200 μL，置于 70℃烘箱中反应 60 min，冷却至室温，加入 0.3 mol/L 的 HCl 溶液200 μL 进行中和。用氯仿萃取过量的PMP，重复3次。收集上清液，过0.45 μm滤膜，待测。

1.3.5 HPLC色谱条件 色谱柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD（250 mm×4.60 mm，5 μm），流动相为乙腈：0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值为6.8）=17∶83，流速1.0 mL/min，柱温40℃，紫外检测波长245 nm，进样量20 μL。

1.4 统计学方法响应面试验采用Design Expert 8.0.6 软件设计，实验设置重复3 次以上（n≥3）。

2 结果

2.1 单因素试验

2.1.1 时间对LBP 产率的影响 在1～4 h 内，随着提取时间增加，多糖在水中的溶解增加，从而产率上升；当提取时间达到4 h 后，多糖产率反而有略微的下降，分析原因，可能是由于长时间的加热引起了多糖的降解［24］。见图1A。

2.1.2 液料比对LBP产率的影响 在20∶1至35∶1内，随着液料比提升，LBP 在水中的溶解有所增加，使得产率具有缓和的增长，当超过40∶1 后，再增加液料比产率反而有所下降，分析原因，可能是溶剂的增加影响了浸提体系的传热和传质，不利于多糖的提取［25］。见图1B。

2.1.3 温度对LBP 产率的影响 在60～85℃，产率随着温度升高具有明显增长，在85～95℃，曲线的变化较为平缓，达到100℃时，多糖产率有所下降，分析原因，可能是过高的温度使得LBP 容易发生分解［26］。见图1C。

图1 不同因素对LBP提取产率的影响

2.2 响应面优化LBP 提取条件的研究综合单因素试验的结果，以提取时间（X1）、液料比（X2）、温度（X3）3 个因素为自变量，以LBP 提取率（Y）为响应值，设计响应面试验分析方案，包括12 个析因实验和5 个中心试验。响应面分析因素与水平取值见表1，试验设计和试验结果见表2。

表1 响应面分析因素与水平

表2 试验设计和试验结果

利用Design Expert软件，对响应值与3个因素进行回归拟合，得到Y对X1、X2、X3的三元二次回归方程为：

回归模型的决定系数R2=0.9834，说明响应值的变化有98.34%来自于所选变量。变异系数值C.V.=1.36%，表明了试验值具有非常高的可靠性。对回归模型进行方差分析，结果如表3 所示。回归项F 值=46.10，P＜0.0001，说明所选模型高度显著［27］。各因素中，一次项、二次项系数P值均小于0.05。结果表明，提取时间（X1）、液料比（X2）、温度（X3）与LBP 的产率（Y）显著相关，其顺序为提取温度＞液料比＞时间。见表3。

表3 回归模型方差分析

2.3 响应面分析的3D图响应面分析的3D曲面图和等高线图，见图2。由图2A 和图2D 可以得出，产率Y随着X1从 3 增加到 3.915 而增加，而之后则随着X1的增加而降低；同理，Y分别在X2、X3为36.633和93.195时达到最大值。可以得出，当X1=3.915，X2=36.633，X3=93.195 时 ，Y达 到 最 大 值4.288%。结合实际情况，将最佳提取条件调整为提取时间（X1）为3.9 h，液料比（X2）为36.6∶1，温度（X3）为93.2℃。在此条件下，实际测得提取率为4.28%，比理论值低0.2%，与模型预测值较为接近，说明用响应面法优化LBP 提取条件的参数可靠。见图2。

2.4 LBP单糖组成测定

2.4.1 方法学考察

2.4.1.1 线性范围 精密称取一定量的甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6 种单糖标准品，置于100 mL 容量瓶定容，配制成浓度分别为48.50、51.30、144.90、301.35、290.08、384.28 μg/mL的对照品溶液。精密量取对照品溶液适量，用水稀释成系列溶液，PMP 衍生化后按照“1.3.5”项下色谱条件进行测定。以单糖峰面积的对数为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性考察。见表4。

2.4.1.2 仪器精密度 取对照品溶液PMP 衍生化后，按照“1.3.5”项下色谱条件，连续进样6 次，对6 种单糖的峰面积值进行测定，计算得其相对标准偏差分别为0.50%、0.11%、0.71%、0.22%、0.30%、0.18（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.1.3 重复性试验 平行配制供试品6 份进行PMP 衍生化后，按照“1.3.5”项下色谱条件进行测定，计算得其相对标准偏差分别为3.25%、3.50%、4.24%、3.44%、3.97%、4.61（n=6），表明方法重复性良好。

2.4.1.4 稳定性试验 取对照品溶液衍生化后，按照“1.3.5”项下色谱条件，于0、2、4、6、8、10、12 h 进行测定，计算得其相对标准偏差分别为0.60%、1.23%、3.92%、2.37%、4.13%、2.33（n=6），表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.2 HPLC 分析 LBP 的柱前衍生化 HPLC 测定结果见图3、表5。可以得出，LBP 由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6 种单糖组成，其含量比为 4.98∶2.93∶8.38∶22.44∶25.38∶35.89。其中，阿拉伯糖含量最高，葡萄糖和半乳糖含量次之，而半乳糖醛酸、甘露糖和鼠李糖的含量较低，这与先前相关研究报道中LBP 的组成［28-29］相近。

图2 响应面分析的3D图

表4 6种单糖的线性范围

图3 LBP的柱前衍生化HPLC测定结果

表5 LBP单糖组成的测定结果

3 讨论

热水提取法作为多糖提取最常用的方法，具有经济安全、易于工业化生产的特点，且极大地保留了LBP 的天然构象。因此，本实验采用水提法提取枸杞中的多糖，并分析其单糖组成。在单因素试验的基础上，应用Design expert 软件，采用Box-Benhnken 试验设计对LBP 进行响应面分析，得到LBP提取产率最优的条件为：提取时间3.9 h，液料比36.6∶1，温度93.2℃，此时产率为4.28%，与模型预测值接近，说明用响应面法优化LBP 提取条件的参数可靠。依据文献中对LBP 单糖组成的报道［30］，采用柱前衍生化 HPLC 法对 LBP 组分进行测定，结果表明其由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖6 种单糖组成，而未检测出木糖。6 种单糖含量百分比为甘露糖∶鼠李糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖=4.98∶2.93∶8.38∶22.44∶25.38∶35.89。