基于AKT 信号通路探讨紫草素对宫颈癌细胞凋亡及Cyclin-D1 蛋白表达的影响

仇晓霞，史晓敏

西北民族大学直属附属医院，甘肃 兰州 730000

宫颈癌是临床常见的妇科肿瘤疾病，有研究显示Th22细胞可通过活化AKT信号通路促进宫颈癌细胞增殖，AKT 信号通路在多种肿瘤中均与肿瘤细胞增殖凋亡有关［1］。通过干预这一信号通路，可以调控肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，影响癌症进展［2］。细胞周期蛋白 1（cell cycle protein 1，Cyclin-D1）是调节细胞周期G1期的一种蛋白，在正常人群中，其表达量较低或不表达［3］。有研究显示［4］，Cyclin-D1在宫颈癌细胞中表达量与正常人群比较具有显著差异，呈明显高表达状态。推测Cyclin-D1 蛋白可通过干扰细胞周期引发肿瘤细胞增殖失控。目前临床对宫颈癌的治疗方法主要包括手术、放化疗，但治疗后存在较明显的手术创伤性、放化疗不良反应等并发症。寻找更有效、不良反应更少的新治疗方法一直是临床研究治疗该病的热点课题。中医认为宫颈癌是因人正气内虚、免疫力降低、外邪入侵伤及胞体导致［5］。紫草具有活血解毒、透疹消斑等效用［6］。其有效化学成分为紫草素，已被证实在促进子宫内膜癌细胞凋亡实验中发挥重要作用［7］。本研究将紫草素作用于体外培养的宫颈癌细胞，观察细胞凋亡情况，探讨紫草素对宫颈癌细胞的作用是否与AKT通路、Cyclin-D1有关。

1 材料与方法

1.1 实验材料人宫颈癌海拉（Hela）细胞（上海研生实业有限公司，批号：ZKCC-X1651）；DMEM 培养基（武汉普诺赛生物，批号：20190420）；胎牛血清（FBS）（赛默飞世尔中国，批号：20190711）；胰蛋白酶-EDTA 消化液、蛋白质提取试剂盒（Solarbio公司，批号：20190404、20190705）；兔源 AkT 多克隆抗体、兔源磷酸化AKT（p-AKT）多克隆抗体、兔多克隆Cyclin-D1 抗体（LSBio，批号：20180709）；总 RNA 提取剂 Trizol（Sangon Biotech，批号 ：20181227）；紫草素粉（上海纯优生物科技有限公司，批号：20190707）；四唑盐（MTT）溶液（上海酶联生物，批号：201811122）。

1.2 实验仪器H3-6815-02 型5% CO2恒温培养箱（Asone），UV752 型分光光度计（山东博科科学仪器有限公司），7500 型实时荧光定量PCR 仪（ABI），DNM-9602型酶标仪（北京普朗医疗）。

1.3 实验方法

1.3.1 药物配制 取10 mg紫草素粉，加入100 μL二甲基亚砜溶液，制成浓度为100 mg/mL的紫草素溶液，将紫草素溶液加入DMEM 培养液中，制成终浓度为8、16、32 μmol/L的溶液。

1.3.2 分组及给药 将Hela 细胞接种于含有10%FBS 的 DEME 培养基中 ，于 5%CO2恒温培养箱培养至对数期。取对数期Hela 细胞，加入10 μL 胰蛋白酶-EDTA 消化液消化，离心半径：13.5 cm，1200 r/min（RCF=1350 g），离心 5 min，弃去上清液，接种于96 孔板中，每孔1×104个细胞、100 μL DMEM 培养液。继续于5% CO2恒温培养箱培养，当细胞生长至80%左右，将细胞分为低浓度组、中浓度组、高浓度组、空白组。各浓度组分别加入浓度为8、16、32 μmol/L的紫草素DMEM细胞培养液，空白组加入不含紫草素DEME 培养液，100 μL/孔，继续于恒温培养箱培养，每组设置3个复孔。

1.4 观察指标

1.4.1 细胞凋亡率 各组继续培养24、48、72 h后，向每组细胞内加入 MTT 溶液 10 μL 显色，孵育4 h 后，设置调零孔、溶媒孔、加药孔，采用酶标仪检测每组在490 nm 处吸光度，每组重复测3 次取均值。MTT 结果中，吸光度越大，表示活细胞数量越多，计算每组细胞凋亡率。细胞凋亡率=1-（加药孔吸光度均值-调零孔吸光度均值）/（溶媒孔吸光度均值-调零孔吸光度均值）×100%。

1.4.2 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA 表达量 采用实时荧光定量PCR仪检测各组AKT、p-AKT、细胞周期蛋白D1 信使核糖核酸（Cyclin-Dlmessenger RNA，Cyclin-D1mRNA）蛋白表达量：采用 Trizol 提取RNA，通过逆转录得到cDNA，PCR 反应条件为95℃ 30 s 预变性、95℃ 10 min 变性、95℃ 15 s 退火、60℃1 min 延伸、95℃10 min 再延伸，循环 40次。将反应体系放入PCR 仪，定量测定目标基因mRNA 表达量，计算△△Ct值=每组△Ct值-空白组△Ct值，以2-△△Ct值表示目标基因mRNA量。见表1。

表1 引物序列

1.4.3 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 蛋白表达量 采用 Western Blotting 法 检 测 各 组 AKT、p-AKT、Cyclin-D1蛋白表达量，再采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法及凝胶成像系统分析蛋白条带。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0 软件分析数据，计量资料以表示，多组间采用单因素方差分析，两两比较采用snk-q 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞凋亡率48 h 时空白组最大凋亡率为（12.37±0.29）%，低浓度组、中浓度组、高浓度组细胞凋亡率均随着时间推移而升高，高浓度组在24、48、72 h凋亡率均明显较高。见图1。

图1 各组细胞凋亡率

2.2 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA表达量细胞AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA 表达量随着浓度的增高而减少，高浓度组均明显低于其他各组（P＜0.05）；中浓度组均明显低于低浓度组及空白组（P＜0.05）；低浓度组表达量低于空白组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组细胞AKT、p-AKT、Cyclin-D1 mRNA表达量

2.3 AKT、p-AKT、Cyclin-D1 蛋白表达量AKT、p-AKT、Cyclin-D1 蛋白量随着浓度的增高而减少，高浓度组均明显低于其他各组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组细胞AKT、p-AKT、Cyclin-D1蛋白表达量

3 讨论

在妇科常见肿瘤中，宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，呈逐年升高、年轻化趋势。采用根治性手术可治疗大部分早期宫颈癌患者，对于中晚期患者而言，可采用手术、放化疗联合治疗，但可能出现多种手术并发症、放化疗不良反应。有研究［8，17］从中药中提取有效成分作为中药单体，应用于肿瘤细胞，取得了较好的促肿瘤细胞凋亡效果。李静等［9］发现芦荟多糖与大黄素对口腔癌细胞有明显抑制作用。马程遥等［10］研究表明番茄枝内酯对乳腺癌细胞有抑制作用。谭大清等［11］研究表示藤黄酸对膀胱癌细胞有明显的抑制作用。

根据中医对宫颈癌的症状及已有文献记载的治疗方法，本研究选取了中药紫草的中药单体作为抗肿瘤药物。紫草味甘、性寒，临床常用于治疗湿疹、紫癜、血尿、烧伤、黄疸［12-13］等。本研究在前期细胞增殖凋亡实验中，已显示出不同浓度紫草素细胞培养液对宫颈癌细胞Hela 的增殖均有抑制作用，且这一抑制作用具有浓度依赖性，在作用24 h 后，高浓度组即可表现出较高的促肿瘤细胞凋亡率。但由于本研究设置组别有限，未能就多种不同梯度的紫草素浓度对Hela 细胞的抑制作用进行分析，也未能得到最佳抑制浓度。在后续实验研究中，还需进一步对紫草素抑制Hela 细胞的最佳浓度进行探究。

紫草素对宫颈癌细胞具有较好的抑制作用被证实后，进一步分析宫颈癌发病机制，发现紫草素的抑制肿瘤细胞增殖作用可能与常见调控肿瘤细胞增殖AKT 信号通路及细胞周期相关蛋白有关。通过对不同浓度紫草素作用后Hela细胞AKT、pAKT表达量进行检测，发现空白组AKT、p-AKT mRNA 及蛋白均高表达，低浓度、中浓度组及高浓度组AKT、p-AKT mRNA 及蛋白较空白组明显降低，且降低幅度随浓度升高而增大，高浓度组AKT、p-AKT mRNA 及蛋白表现出明显低表达。AKT 信号通路是肿瘤细胞重要的胞内信号转导通路，被活化的AKT 可增加核转录因子的活性，促进肿瘤细胞胞内外物质转运，同时激活基质金属蛋白酶，降解细胞外基质，便于肿瘤细胞增殖侵袭［14］。因此本研究结果提示紫草素可通过抑制AKT 信号通路的促肿瘤细胞增殖作用，达到抑制肿瘤的目的。同时，不同组细胞的Cyclin-D1 mRNA及蛋白表达量分析结果显示与AKT 表达结果相似，Cyclin-D1 mRNA及蛋白表达量在被紫草素作用后的各组Hela 细胞中均明显降低。表明紫草素对Cyclin-D1 蛋白也具有抑制作用。Cyclin-D1 在细胞周期中，可与细胞周期蛋白依赖激酶结合，使细胞从G1期进入S 期，进而使细胞分化增殖［15-17］。正常状态下Cyclin-D1 表达量处于稳定状态，过表达的Cyclin-D1会使细胞周期紊乱，细胞不断从G1期进入S 期，导致肿瘤细胞增殖分化速度加快。本研究结果还表明紫草素可通过抑制Cyclin-D1表达，实现抗肿瘤效应。

综上所述，紫草素对宫颈癌Hela 细胞具有明显抑制增殖作用，且这一作用呈浓度依赖性。紫草素对Hela 细胞增殖的抑制作用可能是通过抑制ATK 信号转导通路及Cyclin-D1 蛋白表达而实现的。