基于Wnt/β-catenin 信号通路探讨青藤碱联合脉冲射频缓解SNL 大鼠疼痛的作用机制

王文辉，郭 刚，李长文，陈 良

1 兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000；2 定西市第二人民医院；3 定西市人民医院

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一种由于躯体感觉神经损伤或障碍引起的全球性的疼痛疾病，目前仍无可靠的治疗方法，不仅严重影响患者的生存质量［1］，给个人、家庭和社会也带来了巨大的经济负担［2］，而且可诱发患者焦虑、抑郁等负面情绪。据不完全统计，我国目前NP 患者至少有1600万［3］，而且随着年龄的增长而增加；同时NP 的具体发病机制不清，使得目前缺乏有效的治疗手段，因此，寻找有效的治疗方法具有重要的意义。

疼痛是机体的自我保护性机制，主要表现为离子通道的改变、局部神经炎症、异位刺激和错误信号转导等［4］。随着对神经病理性疼痛研究的不断深入，药物治疗的新靶点不断被发现，如小胶质细胞通路［5］、Notch 信号通路［6］、P38MAPK 通路［7］、Wnt 信号通路等［8］。研究还发现，在 NP 的神经性炎症发展中Wnt/β-catenin 信号通路可能起到重要的作用［9］，Wnt/β-catenin信号通路会导致与NP有关的炎性因子的过表达等［10］。

青藤碱是从中药青风藤中提取出的具有抗炎、镇痛、免疫抑制等药理作用的生物碱单体［11-13］，临床广泛应用于急性关节炎及类风湿性关节炎等疼痛性自身免疫疾病的治疗［14-15］。但是单纯的药物治疗无法完全逆转患者疼痛的病理过程，脉冲射频联合药物治疗是近年应用较为广泛的一种治疗神经性疼痛性疾病的方法，且疗效较佳［16-17］。但是青藤碱联合脉冲射频治疗法对神经病理性疼痛的治疗效果尚无报道，本研究利用青藤碱及脉冲射频治疗法治疗脊神经结扎（spinal nerve ligation，SNL）持续性术后疼痛大鼠，探讨该疗法通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路对大鼠SNL后神经痛的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器青藤碱（115-53-7，上海源叶生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（Beyotime，中国江苏，批号：P0013B）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，批号：P0010）、增强型化学发光试剂（Beyotime，批号 ：P0018）、PVDF 膜（Merck Millipore，批号：HVHP29325）、SDS-PAGE 凝胶试剂盒（Beyotime，批号：P0012A）；兔抗C-fos 多克隆抗体（Abcam，批号：ab209794）；兔抗 Wnt-3α 多克隆抗体（Abcam，批号：ab32249）；兔抗β-catenin 多克隆抗体（Abcam，批号：ab16051）；Trizol（Takara，批号：9109）；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，批号：RR047A）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Takara，批号：RR820L）。

1.2 实验动物采用8 周龄SD 雄性大鼠135 只，体质量约180～200 g，购自兰州大学实验动物中心，实验动物合格证号：SCXK（甘）2018-0002。饲养条件：在室温下给予正常完全营养和自来水常规饲养，自由饮食进水，光照周期12 h/12 h。

1.3 实验方法

1.3.1 分组方法 采用随机数字表法将135 只大鼠分为5 组：假手术组、模型组、青藤碱组、射频治疗组及联合治疗组。见表1。

表1 实验大鼠分组方法 只

1.3.2 模型制备 将SD 大鼠麻醉后进行脊神经结扎（spinal nerve ligation，SNL）模型制备，沿L4～S1棘突做后正中偏右切口，暴露横突的根部，用弯成直角的针头向头端插入孔内。当针头触及DRG 或神经根可引起同侧后肢肌肉轻微抽动，退出针头。结扎神经，缝合，腹腔连续3 天注射青霉素。假手术组除不进行背根神经结扎外，其余操作同其他组。

1.3.3 给药方法 术后第1 天开始（SNL 当天视第 0 天）进行药物［青藤碱 8 mg/（kg·d）］或/和脉冲射频治疗（在背根神经结扎近端，距线结5 mm处，脉宽20 ms、频率500 kHz，脉冲频率2 Hz，温度42℃，持续时间8 min）。假手术组与模型组给予等量生理盐水灌胃。

1.3.4 机械痛阈测量 所有大鼠在手术前1 天及术后第1、3、5、7、14 天给药或/和脉冲射频干预治疗2 h后，检测各组大鼠进行机械缩足反应阈值（mechanical withdraw threshold，MWT）。每只大鼠每次检测3 次，记下数值后求其均值，每次间断开5 min。

1.3.5 样品采集 各组大鼠SNL 术后3、7、14 天行为能力测试结束后，各组取6 只大鼠麻醉后处死，快速而准确地切取各组大鼠脊髓背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）的 L4～L6节段，立即置于液氮中冻存用于Western Blot 及PCR 检测。另取3 只大鼠麻醉后，开胸经左心室插管进入主动脉根部，剪开右心耳，灌注PBS 冲尽血液，然后采用4℃4%多聚甲醛300 mL 灌注固定1 h。取L4～5节段背根神经节，用于免疫组化检测。

1.3.6 Q-PCR 实验 取收集到的DRG，采用Trizol 法提取 DRG 中总 RNA。并将 RNA 浓度统一稀释至500 ng/mL，用逆转录试剂盒进行反转录，获得的cDNA 作为模板，扩增白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因。扩增引物序列表见表2。反应条件：预变性，95℃10 min，1个循环；热循环，95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，40个循环，扩增结束后确认扩增曲线和溶解曲线，确认得出数据的可信性。计算基因的相对表达量F=2-△△Ct，△△Ct=（待测样品的目的基因的Ct 的平均值-待测样本的内参基因的Ct 的平均值）-（对照样品的目的基因的Ct的平均值-对照样本的内参基因的Ct的平均值）。

表2 引物序列

1.3.7 Western bloting实验 取收集到的DRG，向DRG中加入200 μL蛋白裂解液（含1 mmol/L PMSF），置冰上 20 min 后，离心半径 50 mm，12 000 r/min，离心15 min，取上清液。用BCA 测定蛋白浓度后调节至统一浓度。取20 μg 蛋白样品（12%SDSPAGE，5%脱脂奶粉；90 V，转膜 60 min）室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜兔抗Wnt-3α、β-catenin 多克隆抗体，TBST 洗膜 3 次，10 min/次，二抗室温孵育 1 h（二抗：山羊抗兔 1∶8000），TBST 洗膜 3 次，10 min/次，用Western blot印迹法观察并进行半定量分析。条带采用ImageJ 软件进行灰度值分析。

1.3.8 免疫组化实验 取收集到的DRG，将DRG放入4℃4%多聚甲醛中固定6 h，再放入30%蔗糖4℃过夜，然后将组织包埋成石蜡块，切片、爬片、脱腊后按照免疫组化试剂盒（中杉金桥）进行免疫组化。在倒置显微镜下观察c-fos蛋白表达情况。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0 软件进行数据统计分析，计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 机械痛阈行为测试结果显示，5 组大鼠痛阈基础值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。假手术组MWT随时间无明显变化，其他各组MWT在术后5 天持续下降，随后出现回升趋势；联合治疗组下降幅度最小，而上升幅度最大。与假手术组相比，其他各组MWT 在术后均显著低于假手术组（P＜0.05）。与模型组相比，各治疗组MWT 在术后下降幅度较小，而上升幅度较大。见表3。

表3 各组大鼠机械痛阈值比较（）

表3 各组大鼠机械痛阈值比较（）

注：*表示与假手术组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；▲表示与本组造模后1天比较，P＜0.05

组别假手术组模型组青藤碱组脉冲射频组联合治疗组术后14 d 16.26±1.54 7.38±0.08*▲8.46±0.30*#9.31±1.23*#10.25±1.89*#鼠数6 6 6 6 6术前1 d 15.82±0.89 16.15±0.21 15.91±1.05 15.75±1.23 16.06±0.88术后1 d 15.53±0.12 9.35±0.25*9.41±0.09*9.49±0.28*9.58±0.87*术后3 d 14.5±0.74 8.21±0.56*8.56±0.05*8.86±0.47*9.01±0.92*#术后5 d 15.15±1.06 7.20±0.36*▲7.79±0.14*▲8.16±0.85*▲8.32±0.96*#▲术后7 d 15.83±1.05 7.31±0.58*▲7.82±0.24*▲8.31±0.85*#▲8.51±1.23*#

2.2 TNF-α、IL-1β mRNA表达与假手术组比较，模型组IL-1β、TNF-α mRNA 相对表达量显著升高，并随时间的加长逐渐升高；与模型组比较，各治疗组IL-1β、TNF-αmRNA 表达随着治疗时间的增长而显著降低，联合治疗组下降幅度最大。按照不同治疗时长分类，发现在手术后3 天各组间IL-1β、TNF-α 基因相对表达量差异不显著（P＞0.05）；在第 7 天时除模型组外，各治疗组 IL-1β、TNF-α 基因相对表达量开始下降；14 天下降更为显著，其中联合治疗组表达量下降最为显著。见图1。

2.3 c-fos 蛋白表达与假手术组比较，模型组c-fos 蛋白相对表达量明显升高，并随时间的增长逐渐升高；与模型组比较，各治疗组c-fos 蛋白相对表达量随着治疗时间的增长而显著降低，其中在同一时间青藤碱组下降幅度最小，联合治疗组下降幅度最大。见图2—3。

图1 各组脊髓背根神经节中TNF-α、IL-1β mRNA的相对表达量比较

图2 脊髓背根神经节中c-fos蛋白的相对表达

图3 各组脊髓背根神经节中c-fos蛋白的相对表达比较

2.4 Wnt-3α、β-catenin 蛋白表达与假手术组比较，模型组Wnt-3α、β-catenin 蛋白表达量均显著升高（P＜0.05），但随时间的加长差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，各治疗组Wnt-3α、β-catenin 蛋白表达量均随时间增长而显著下降（P＜0.05），其中在同一时间下联合治疗组下降幅度最大。见图4—5。

图4 脊髓背根神经节中Wnt-3α、β-atenin蛋白的相对表达

图5 各组脊髓背根神经节中Wnt-3α、β-catenin蛋白的相对表达比较

3 讨论

NP 是由于神经系统受到损伤或产生病变而引起的疼痛［18］，通常定义为由外周或中枢神经疾病及损伤引起的慢性疼痛综合征，其主要特征有痛觉过敏、自发性痛及异常痛［19-20］。由于NP 的发病机制复杂、难以治愈、患病率高等，人们将其称为“不死的癌症”，联合用药是目前比较有效的治疗NP 的途径［21-22］。青藤碱通常被用于抗炎止疼［23］，脉冲射频对神经疼痛的治疗具有显著的效果［24］。因此，本研究通过构建SNL 持续性术后疼痛大鼠模型，利用青藤碱、脉冲射频治疗法及两者联合治疗法3 种方法进行治疗，观察青藤碱联合脉冲射频治疗法通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路对大鼠SNL 后神经痛的治疗效果。MWT 评价治疗结果发现，青藤碱联合脉冲射频疗法治疗NP 的效果最佳。

神经疼痛是神经炎症的主要特征，是一种周围或中枢神经系统的局部炎症［25］。本研究结果显示，大鼠SNL 模型组中与NP 有关的炎性因子IL-1β、TNF-α mRNA相对表达量显著升高，并随时间的加长逐渐升高；与模型组相比，各治疗组IL-1β、TNF-α mRNA 表达随着治疗时间的增长而显著降低，而联合治疗组脊髓背根神经节中TNF-α、IL-1βmRNA 的表达显著低于其他各组。提示NP 的产生和维持可能与炎症因子过表达密切相关，联合治疗组能有效的抑制炎症因子的合成与释放，从而缓解NP 的维持。进一步研究发现各治疗组脊髓背根神经节中c-fos 蛋白的表达随着时间的增长而降低，其中联合治疗组下降的幅度最大，提示青藤碱联合脉冲射频疗法能有效的缓解NP 的发展与维持。

本研究检测了SNL大鼠背根神经节中Wnt/βcatenin 信号通路相关因子 Wnt-3α 和β-catenin蛋白的表达情况，发现大鼠SNL 模型组中Wnt-3α和β-catenin 蛋白的相对表达量显著升高；与模型组相比，各治疗组Wnt-3α 和β-catenin 蛋白的相对表达显著降低，而联合治疗组脊髓背根神经节中Wnt-3α 和β-catenin 蛋白的相对表达显著低于其他各组。提示Wnt/β-catenin 信号通路在神经损伤大鼠背根神经节中被广泛激活，可能与NP 的产生和维持有关；联合治疗组能有效的抑制Wnt/β-catenin 信号通路相关因子 Wnt-3α 和βcatenin 蛋白的相对表达。Wnt/β-catenin 信号转导通路是一条在生物进化中极为保守的通路［4］，但是当细胞外 Wnt 信号被激活后，Wnt 配体与富含半胱氨酸的卷曲区域受体和FZ 供受体结合，使细胞质中β-catenin 积累起来，从而激活细胞内的信号级联和目的基因的转录。以上提示，青藤碱联合脉冲射频法可能通过调节富含半胱氨酸的卷曲区域受体和FZ供受体，抑制Wnt的活性、使β-catenin 降解，从而影响神经损伤后NP 的发生发展过程。

综上所述，青藤碱联合脉冲射频疗法能显著降低SNL大鼠背根神经节中炎症相关因子和c-fos的表达及Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白的表达，从而的缓解SNL 大鼠神经痛，提示青藤碱联合脉冲射频疗法通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白的表达，可影响炎症因子和c-fos 的表达而参与NP的发生发展，从而缓解SNL大鼠疼痛。