化瘀通阳方对溃疡性结肠炎大鼠IL-23/JAK-STAT 信号通路的影响*

杨 洁，施丽婕

1 天津中医药大学研究生院，天津 301617；2 天津中医药大学第一附属医院

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以肠道炎症和肠黏膜损伤为主要病变特征的非特异性炎性肠病。目前研究发现肠道免疫失调在诱导UC发生发展的过程中发挥重要作用［1］。白细胞介素 23（interleukin-23，IL-23）作为一类由免疫细胞分泌的细胞因子，其可以通过激活非受体酪氨酸激酶（just another kinase，JAK）信号转导蛋白及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号转导途径，产生致炎因子，促进或加重机体炎症反应，诸多研究表明IL-23 在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和其他自身免疫相关疾病中具有强烈的治疗靶向性［2］，近年来中医药在调控IL-23 表达治疗疾病方面取得良好疗效［3］。化瘀通阳方由薤白、五灵脂、蒲黄组成，该方具有通阳、散瘀、止血之功，能够在宣通机体郁滞之卫阳的同时携营气行经络达病所，卫主营从［4］，营卫同调，刚柔相得，进而增强机体御邪能力和免疫作用，促进自我修复。课题前期研究已经证实该方在UC 肠屏障方面可以改善肠道血液高凝状态，降低肠黏膜通透性，促进黏膜愈合，恢复肠道功能。基于此本研究进一步从炎症-免疫方面探讨化瘀通阳方对UC 大鼠IL-23 水平及JAK-STAT信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择雄性8 周龄Wistar 健康大鼠32 只，体质量约（210±10）g，购自北京维通利华实验动物有限公司，实验动物许可证号：SCXK-（京）2016-0006。所有大鼠置于相同环境条件下适应性饲养7天，饲养温度（24±1）℃，湿度45%±15%，自由饮水、进食。

1.2 药物及仪器化瘀通阳方药物组成：五灵脂10 g，薤白10 g，蒲黄10 g（上述药物均由天津中医药大学第一附属医院药剂科提供）；美沙拉嗪灌肠液（莎尔福，德国Falk 药厂，批号：17B16）；葡聚糖硫酸钠（DSS，美国MP 公司，批号：18008540530）；ELISA 检测试剂盒（RayBiotech，批号：Q91Z84）；Bradford 法蛋白定量试剂盒（北京普利来基因技术有限公司，批号：P1510）；BSA 标准品（BBI life sciences，批号：B600036-0260）；四甲基乙二胺试剂（Diamond，批号：A100761-0025）；台式高速离心机（Eppendrof）。

1.3 实验方法在32 只大鼠中随机选取8 只大鼠设为空白对照组，不加干预；剩余24 只大鼠设为模型复制组并采用5%葡聚糖硫酸钠溶液（DSS）灌胃结合自由饮用，7天后随机选取其中6只大鼠和空白对照组2 只大鼠采用颈椎脱臼法处死，剖取结肠组织并进行病理组织学检查，观察造模是否成功。造模成功后第2 天，将模型复制组18 只大鼠按随机数字表法分为模型组、化瘀通阳组和美沙拉嗪组，每组6 只，未加干预的6 只大鼠为空白对照组。空白对照组和模型组大鼠均给予生理盐水2 mL/只灌肠，化瘀通阳组和美沙拉嗪组分别予化瘀通阳方剂、美沙拉嗪灌肠液各2 mL/只灌肠，各组大鼠每天灌肠1 次，连续治疗10 天。10天后将全部大鼠采用颈椎脱臼法处死，剖取其结肠组织留用。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分 观察大鼠精神及活动状态、饮食情况、大便性状，利用邻联甲苯胺法对每组大鼠粪便进行便潜血检测，并结合每日体质量变化作出DAI评分，评分标准见表1。

1.4.2 结肠长度变化及组织病理学检查 测量比较各组大鼠结肠长度后将结肠组织剪成1～1.5 cm2大小、3～4 mm 厚的小块用福尔马林固定，常规包埋、切片，HE 染色，显微镜下观察结肠组织病理情况。

表1 DAI评分标准

1.4.3 组织IL-23 含量的检测 将大鼠结肠组织称重后剪碎，置于玻璃匀浆器中，于干冰上充分研磨，离心提取上清液。使用ELISA 检测试剂盒，严格按照说明书步骤对IL-23含量进行检测。

1.4.4 组织 JAK1、TYK2、STAT1、STAT4 蛋白的表达 将大鼠结肠组织样本进行匀浆、裂解，收集蛋白样品加入缓冲液，热浴5 min 以充分变性蛋白。待冷却后上样、电泳。60 V电压下2 h转膜，TBS室温摇床清洗10 min，加入TBST稀释的5%脱脂奶粉室温摇床上封闭1 h。取出膜加入一抗，4℃过夜孵育。完成后放入TBST 中室温摇床洗涤10 min/次×3 次，TBS 洗涤 10 min 后加入二抗孵育 1 h，洗膜同前。最后将膜置入化学发光液A+B 混合液中1 min 取出，在暗室中剪下与膜同样大小的胶片，压在暗盒中1 min，放在显影液中显影，出现明显条带后置于定影液中定影5 min，冲洗，晾干。利用凝胶图像处理系统进行组织JAK1、TYK2、STAT1、STAT4蛋白的表达分析计算。

1.5 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件对实验数据进行统计分析，符合正态性分布，计量资料用表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，不符合正态性分布，组间比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DAI 评分1）造模期间，空白对照组大鼠精神及活动状态良好，正常饮食，体质量逐日增加；模型复制组大鼠则表现出精神萎靡，少饮少食，稀便、血便及肛周溃烂，体质量下降，造模期间死亡3 只。模型复制组大鼠DAI 评分与空白对照组比较明显升高，造模第5 天疾病活动情况变化显著，见图1A。2）治疗期间，模型组大鼠于第4天死亡1只，整体改善不明显，仍有血便、稀便，体质量虽有增长，但与给药组相比趋势较缓；化瘀通阳组、美沙拉嗪组两组大鼠精神及活动状态均有明显改善，饮食较前增多，大便逐渐恢复正常，体质量呈现明显上升趋势，DAI评分显著下降，见图1B。

图1 造模期和治疗期各组大鼠DAI评分变化趋势

2.2 结肠长度大鼠肠管长度模型组为（11.63±0.48）cm，空白对照组为（16.00±1.26）cm；化瘀通阳组为（15.80±1.64）cm，美沙拉嗪组为（15.80±0.84）cm。化瘀通阳组、美沙拉嗪组大鼠肠管短缩情况明显改善，黏膜充血水肿不明显，未见明显溃疡。且两组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 结肠病理学观察空白对照组大鼠肠管表面光滑完好，黏膜各层结构清晰，无炎细胞浸润，黏膜无充血水肿及溃疡形成；模型组肠管黏膜下层有大量炎细胞浸润，杯状细胞大面积丢失，隐窝结构紊乱，黏膜粗糙、充血水肿，溃疡形成；化瘀通阳组和美沙拉嗪组肠管短缩情况明显改善，镜下可见少量杯状细胞丢失，炎细胞浸润仅限于黏膜层，黏膜充血水肿不明显，未见明显溃疡。见图2。

图2 各组结肠病理学表现（HE×400）

2.4 实验室指标模型组大鼠结肠组织中IL-23含量较空白对照组明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，化瘀通阳组、美沙拉嗪组大鼠结肠组织中IL-23 含量明显下降（P＜0.01），且两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组比较，模型组大鼠结肠组织中JAK1、STAT1、STAT4 表达升高；与模型组比较，化瘀通阳组、美沙拉嗪组大鼠结肠组织中 JAK1、STAT1、STAT4 表达均下调，且两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；各组间TYK2 表达无差异（P＞0.05）。见表2、图3。

表2 各组大鼠IL-23、AK1、TYK2、STAT1、STAT4水平比较（）

表2 各组大鼠IL-23、AK1、TYK2、STAT1、STAT4水平比较（）

注：与空白对照组比较，*表示P＜0.01，▲表示P＜0.05；与模型组比较，＃表示P＜0.01，※表示P＜0.05

组别空白对照组模型组化瘀通阳组美沙拉嗪组STAT4 0.381±0.165 1.586±0.762▲0.546±0.062※0.505±0.188※鼠数3 3 3 3 IL-23（μg/mL）186.250±80.030 1643.330±556.851*544.471±348.491#444.647±253.719#JAK1 0.418±0.224 2.396±0.616*0.895±0.051#0.898±0.601#TYK2 0.223±0.163 0.584±0.102 0.338±0.036 0.507±0.646 STAT1 0.522±0.172 1.630±0.166*0.599±0.137#0.516±0.178#

图3 各组大鼠结肠组织中JAK1、TYK2、STAT1、STAT4含量

3 讨论

JAK-STAT 信号通路在炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）炎性反应中起着重要作用，目前被认为是IBD 的潜在治疗靶点。多种细胞因子均依赖于JAK-STAT 信号通路促发肠道炎症反应，抑制该通路可能导致多种炎性细胞因子的下调［5］，从而减缓组织损伤，促使肠黏膜愈合。IL-23 是IL-12 异二聚体细胞因子家族的新成员，结构上与IL-12相似［6］，功能却不尽相同，主要促进Th17细胞的最终分化，诱导IL-17A和干扰素 γ 产生［7］。IL-23 作为 JAK-STAT 信号通路的始动因子之一，与细胞膜上相应受体结合激活下游JAKs分子，随后磷酸化相关STAT分子形成二聚体或多聚体等，随着细胞核发生转位，使STAT 磷酸化产物特异性结合于DNA 序列，从而调节下游靶基因的转录，影响相关细胞因子表达和蛋白质合成［8］。PARHAM 等［9］在对免疫细胞 IL-23 下游信号通路的研究中检测到不同含量的STAT1、STAT3、STAT4 存在，说明IL-23 可以不同程度地激活STAT1、STAT3、STAT4 分子表达。研究表明溃疡性结肠炎患者血浆及组织中IL-23 过表达，且与疾病病理分级有明显相关性［10］，组织中STAT1、STAT4 含量增高［11-14］，提示 IL-23、STAT1、STAT4 均可能参与溃疡性结肠炎的炎症反应。

本研究通过对各组大鼠DAI 评分及结肠长度的比较，结合组织病理切片观察，发现化瘀通阳组大鼠DAI 评分及肠管短缩情况均得到显著改善，炎细胞浸润减少，肠黏膜恢复至正常结构，说明化瘀通阳方可以通过控制炎症反应，减轻组织损伤，恢复肠道功能。同时，研究发现模型组大鼠结肠组织中IL-23含量和JAK1、STAT1、STAT4蛋白表达明显增高，化瘀通阳组可以降低组织IL-23 水平和 JAK1、STAT1、STAT4 蛋白过度表达，与空白对照组比较无明显差异，提示IL-23 可能作为一种前炎症因子通过活化JAK-STAT 信号途径，产生其他炎性因子作用于结肠组织而发挥致炎作用，化瘀通阳方则能够减少组织中IL-23 的含量，从而抑制JAK-STAT 信号通路过表达，减少其他致炎因子的产生，减轻组织炎症损伤，达到治疗UC的目的。

化瘀通阳方立足于UC 卫阳郁滞、气滞血瘀的病机特点［15-16］，认为卫阳在机体防卫免疫方面具有不可忽视的重要作用。卫阳作为机体阳气中的一部分，由于其性慓疾滑利，能快速应对邪气而达病所，具有主动向病患集结的趋向性以抵御邪气［4］，故认为卫阳在一定程度上参与机体的炎症免疫调节。方中薤白辛温，功在宣通卫阳，程书彪［16］利用Griess 法间接检测小鼠巨噬细胞中炎性因子含量首次发现薤白皂苷类化合物20 有明显抗炎活性，与五灵脂、蒲黄同用，还能够改善机体因阳气郁滞造成血瘀的病理变化，正所谓“营卫二气人身并重，未可重卫轻营也”。