TRPV4-P38α通路在背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用*

张 晓 闫平平 张丽娟 阴 涛 高 强 郑遵成

1.泰安市中心医院康复科，山东 泰安 271000；2.山东第一医科大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，山东 泰安 271000

神经病理性疼痛是临床上常见且难治的一类慢性疼痛，因其具体发病机制不明，治疗效果差，严重影响患者的生活质量。背根神经节持续受压(chronic compression of the dorsal root ganglion, CCD)模型是一种常见的动物模型，可以很好地用于神经病理性疼痛发病机制的研究[1]。CCD 后大鼠能够产生自发性疼痛、痛觉过敏等现象，能很好地模拟神经病理性疼痛常见症状[2]。瞬时感受器电位离子通道4(transient receptor potential vanilloid 4, TRPV4)是一种非选择性阳离子通道，具有机械敏感性，广泛分布于动物脑、背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)、肾和肺等组织[3]。研究表明[4]，TRPV4参与CCD所致神经病理性疼痛的病理过程。P38MAPK信号转导通路是细胞内重要的信号传导系统，参与介导神经病理性疼痛病理过程，而P38MAPK分为P38α、P38β、P38γ和P38δ4个亚基，针对某个亚基在CCD所致神经病理性疼痛的研究较少。P38α是哺乳动物中主要的亚基之一，在背根神经节以及脊髓中广泛存在[5]。研究表明[6]，予以P38αMAPK抑制剂SD-282可以显著逆转糖尿病神经病理性疼痛模型大鼠的机械异常性疼痛，提示P38αMAPK在慢性疼痛的调节过程中发挥重要作用。本研究通过探讨CCD后背根神经节细胞TRPV4和P38α基因表达的变化与大鼠机械刺激性疼痛的关系，初步明确TRPV4-P38α信号通路在CCD致神经病理性疼痛中的作用，以期为今后神经病理性疼痛的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康成年雄性Wister大鼠50只，体重为200～220 g，购自山东大学动物实验中心。大鼠室温、常湿饲养，普通饮食、自由饮水。随机分为空白组10只、CCD手术组30只(术后1 d、7 d、21 d，各10只)、CCD+钌红组10只。

1.2 实验主要试剂及仪器

反转录试剂盒 ReverTra Ace® qPCR RT Kit(东洋纺，日本)、PCR 试剂盒 SYBR® Green Realtime PCR Master Mix(东洋纺，日本)，引物，Tgradient 96 反转录仪，lightcycler 2.0 型实时定量 PCR仪(Roche公司，瑞士)；钌红(sigma，德国)；BME-404 型电子式机械测痛仪(中国医学科学院生物工程研究所)。

1.3 CCD模型的制备

参考胡三觉等[2]制作CCD模型的方法：腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，腰背部剃毛，75%酒精消毒皮肤，铺无菌洞巾。沿两侧髂棘连线正中向上做一约2 cm皮肤切口，分离右侧椎旁肌肉，充分暴露右侧 L4、L5 椎体横突及椎间孔，将直径0.63 mm“L”形棒的长端沿L4及L5椎间孔的前壁与脊柱斜向上成 30°角插入椎间孔内，短端置于椎间孔外。术后用生理盐水冲洗切口，依次缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤，腹腔注射青霉素 40 万单位预防感染。排除术后出现肢体瘫痪的大鼠。

1.4 大鼠机械刺激缩爪反应阈值测量

空白组及CCD手术组于术前1 d、术后1 d、7 d和21 d进行机械刺激痛阈值测量，CCD+钌红组于术后第7天鞘注TRPV4抑制剂钌红10 μl(10 μmol/L)2 h前后均进行机械刺激痛阈值测量。方法如下：大鼠于红色半透明玻璃箱内适应环境30 min后，使用BME-404型电子式机械测痛仪测量大鼠右后肢缩爪反应阈值。透过玻璃箱底部网格层以针刺端垂直刺激大鼠后肢足底第三、四趾间皮肤，大鼠出现缩爪或舔足现象视为阳性，记录刺激数值(G)，每次刺激间隔 5 min，连续测 5 次，取其平均值作为统计变量。

1.5 动物组织取材

各组大鼠进行机械刺激缩爪反应阈值测量后将大鼠处死取材：腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，开胸，200 ml 预冷生理盐水经左心室快速灌注，冰上快速取出L4及L5背根神经节，-80℃冰箱保存。

1.6 实时荧光定量PCR

取L4及L5背根神经节，1×PBS 清洗、修剪后，采用Trizol法提取组织总mRNA，紫外分光光度计测量RNA浓度，按照TOYOBO公司ReverTra Ace®qPCR RT Kit 说明书进行逆转录反应，将逆转录产物cDNA -20 ℃保存备用；取1 μg cDNA，按照TOYOBO公司SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 说明书进行操作，应用Roche公司lightcycler 2.0型实时定量PCR仪进行。

TRPV4引物序列为：

Forward: 5′-AAGTGGCGTAAGTTCGGG-3′

Reverse: 5′-TAAGGGTAGGGTGGCGTG-3′

P38α引物序列为：

Forward:5′-CGTTGCCGAGGCTCGTAG-3′

Reverse:5′-GCCTCTCCTGCGACATCTTC-3′

GAPDH引物序列为：

Forward: 5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′

Reverse: 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′

扩增条件：预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 6s，退火56 ℃ 10 s，共40个循环；延伸72 ℃ 15 s。扩增完毕进行溶解曲线分析，记录各管中CT值。实验结果采用2-ΔΔCT方法进行分析。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠背根神经节持续受压后机械痛阈变化

与空白组相比，CCD1 d、7d、21 d组大鼠术侧机械刺激痛阈值明显下降；与CCD1 d组和CCD21 d组相比，CCD7 d组大鼠术侧机械刺激痛阈值明显下降；以上差异均有统计学意义(P<0.001)；见表1。

表1 大鼠背根神经节持续受压后术侧机械痛阈变化

与空白组相比：①P<0.001；与CCD1 d组和CCD21 d组相比：②P<0.001。

2.2 术后第7天鞘注TRPV4抑制剂钌红2 h后机械痛阈变化

与给药前相比，鞘注TRPV4抑制剂钌红2 h后CCD大鼠术侧机械刺激痛阈值明显升高，差异有统计学意义(P<0.001)；见表2。

表2 鞘注TRPV4抑制剂钌红2 h后术侧机械痛阈变化

与CCD组相比：①P<0.001。

2.3 大鼠背根神经节持续受压后背根神经节细胞TRPV4和P38α基因表达变化

与空白组相比，CCD组大鼠术侧背根神经节细胞内TRPV4和P38α基因表达水平均明显升高；与CCD1 d和21 d组相比，CCD7 d组大鼠术侧背根神经节细胞内TRPV4和P38α基因表达水平明显增加，以上差异均有统计学意义(P<0.001)。见图1。

图1 RT-PCR检测大鼠术侧背根神经节TRPV4和P38α基因表达变化与空白组相比：①P<0.001；与CCD1 d组和CCD21 d组相比：②P<0.001。

2.4 鞘注TRPV4抑制剂钌红2 h后大鼠背根神经节细胞P38α基因表达变化

与给药前相比，鞘注钌红2 h后，CCD组大鼠术侧背根神经节细胞P38α基因表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.001)。见图2。

图2 RT-PCR检测大鼠术侧背根神经节P38α基因表达变化与空白组相比：①P<0.001；与CCD组相比：②P<0.001。

3 讨 论

神经病理性疼痛是临床常见的一种慢性疼痛，其发病机制复杂，临床治疗效果差，严重影响患者的生活质量，给家庭及社会带来沉重负担[7]。研究发现[5]，细胞内多种信号通路介导了神经病理性疼痛的病理过程，而且多数的信号通路都汇集于P38MAPK。Piao等[8]发现，慢性压迫性神经损伤可导致大鼠背根神经节细胞P38 MAPK表达增加，而鞘内注射p38 MAPK抑制剂SB203580，在下调其表达的同时可以显著减少大鼠机械痛和温痛觉的超敏现象。已知P38MAPK由P38α、P38β、P38γ和P38δ 4个亚基构成。P38α主要分布在背根神经节，P38β在脑组织小胶质细胞中含量较多，P38γ多见于骨骼肌，p38δ多见于肠、肺、肾和唾液腺的表皮细胞[5]。研究已证实，P38MAPK信号转导通路参与介导了神经病理性疼痛病理过程，然而在介导慢性疼痛过程中何种亚基起主要作用尚不清楚。Morganti等[9]的研究表明，小胶质细胞内P38αMAPK缺失可以降低创伤引起的炎症反应，从而减轻疼痛反应。另有研究发现[10]，予以P38αMAPK抑制剂UR13870可以明显减低脊髓损伤大鼠的情感性疼痛行为。Galan-Arriero等[11]发现，神经病理性疼痛与小胶质细胞P38αMAPK信号通路的激活关系密切，其研究发现予以P38αMAPK抑制剂UR13870可显著减少SNI模型动物对机械刺激和冷刺激的后肢反射亢进现象，并且对一般运动功能无影响，同时还能减轻SNI模型动物因疼痛所致的相关性焦虑行为。以上研究表明，P38αMAPK作为P38MAPK的亚基之一，在神经病理性疼痛的发生过程中发挥重要作用。

瞬时感受器电位离子通道(transient receptor potential channel, TRP)在高等动物组织器官内广泛分布并参与视觉、听觉、味觉、触觉和痛觉等多种感觉信号的转导过程[12]。TRPV4 属 TRP 香草素受体亚家族成员，在背根神经节神经元胞膜、胞浆和胞核中均有表达，其作为多觉感受器，可被酸、机械牵张力、低渗透压、花生四烯酸和4α-佛波酯等激活[13]。张杨等[4]研究发现，背根神经节持续受压模型(CCD模型)大鼠术侧后肢表现出明显的机械痛和热痛觉过敏，同时背根神经节细胞内检测出TRPV4基因和蛋白表达明显增加，予以TRPV4反义核苷酸干预可以部分逆转CCD所致痛觉过敏现象，该研究提示，TRPV4在介导神经病理性疼痛中发挥一定作用。国外研究发现[14]，激肽受体通过敏化TRPV4离子通道诱导紫杉醇引起的啮齿类动物周围神经病痛觉敏化过程。在Dias FC等[15]的研究中，使用选择性TRPV4通道拮抗剂HC-067047减轻了糖尿病神经病理性疼痛模型小鼠的机械性异常性疼痛，提示TRPV4可能参与了机械性痛的产生。以上研究采用不同的动物模型均表明TRPV4离子通道在神经病理性疼痛的发病过程中起重要作用。

背根神经节持续受压模型(chronic compression of dorsal root ganglion，CCD)是目前常用的研究神经病理性疼痛发病机制的模型之一[1]。CCD大鼠表现出明显的异常疼痛和痛觉过敏，可以模拟临床上根性神经痛的典型症状[2,4]。目前，利用CCD模型对TRPV4-P38MAPK信号通路的研究多停留在蛋白水平，曲玉娟等[16]证实大鼠背根神经节细胞TRPV4和P38MAPK蛋白表达明显影响大鼠的机械痛阈值，表明TRPV4-P38MAPK信号通路参与介导了CCD所致神经病理性疼痛过程。但从基因水平及P38MAPK具体亚基的参与方面的研究较少。本实验通过构建CCD模型，对P38MAPK的亚基P38α及TRPV4的基因表达进行研究。实验发现，CCD组大鼠较空白组均表现出术侧机械痛阈值的明显降低，这与其他学者的研究结果相类似，CCD组大鼠术侧TRPV4和P38α基因表达均上调明显，其中，CCD术后7 d组TRPV4和P38α基因的表达水平较CCD1 d和21 d组更明显，二者的变化曲线与我们测得的CCD后大鼠术侧机械刺激痛阈值的变化存在相关性。既往研究表明[16]，鞘注TRPV4抑制剂钌红在显著下调CCD大鼠术侧TRPV4蛋白表达的同时，还可以降低其基因的表达水平。本实验在CCD术后第7天对TRPV4进行干预，结果发现大鼠机械刺激痛被部分逆转的同时，背根神经节细胞P38α基因的表达水平亦较前显著降低，提示P38α与TRPV4在介导CCD所致神经病理性疼痛的过程中存在相关性。

综上所述，TRPV4-P38α通路参与介导了CCD所致神经病理性疼痛病理过程。本研究从基因水平阐述了TRPV4-P38α通路在CCD所致神经病理性疼痛中的作用，对P38α蛋白水平及其具体上下游分子机制仍需做进一步探讨。