黄金针菇混悬菌种制剂的研究*

贺宗毅 ，李 卿 ，张德利 ，罗昌树 ，陈仕江 **

（1.重庆市中药研究院，重庆400065；2.重庆市中药资源学重点实验室，重庆400065；3.中国中医科学院，中药资源中心重庆分中心，重庆400065）

金针菇 （Flammulina filiformis） 是著名的食（药）用菌，又称冬菇、朴菇、构菌等，隶属于担子菌门 （Basidiomycota） 伞菌纲 （Agaricomycetes） 伞菌目（Agaricales） 膨瑚菌科（Physalacriaceae） 小火焰菌属（Flammulina）[1]。黄金针菇是我国食用菌产业技术最成熟的品种之一，根据统计数据显示，金针菇年产量在香菇（Lentinula edodes）、侧耳属（Pleurotus）、黑木耳 （Auricularia auricula） 之后，位居第四位，年总产量达260万吨左右[2]。其子实体含有的多糖、蛋白质、萜类化合物和构菌素等活性代谢产物，具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗过敏、改善记忆障碍、抗氧化以及保肝护肝等多种生物活性[3-8]。

黄色金针菇菇味浓郁，口感较白色金针菇脆嫩爽滑，深受广大消费者青睐。因金针菇具有温度适应性广，栽培、管护简单，投资小、见效快等特点，可作为贫困地区农户脱贫增收项目[9-11]。近年来，随着黄金针菇推广范围及面积的扩大，有望成为贫困山区脱贫的主导产业。目前，重庆有18个深度贫困乡镇，均分布于重庆渝东南和渝东北山区，这些山区生态环境良好，海拔1 000 m以上，年平均气温16℃～18℃，非常适宜食用菌的生长[10]。但山区农户栽培黄金针菇存在规模小、分散程度高、集约化程度低等缺点，传统固体菌种和液体菌种均不适合在山区推广，而安全、稳定的菌种供应成为贫困山区农户栽培黄金针菇的拦路虎。因此研制易运输、易储藏、活力强的小单位生产用菌种制剂是解决上述问题的关键。目前国内外尚未见黄金针菇菌种制剂的研发报道。因外，研发黄金针菌种制剂及采用的供应模式为山区农户栽培其他食（药）用菌及产业扶贫提供了借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试菌株：黄金针菇（Flammulina filiformis） 菌种，保存于重庆市中药研究院；溶剂油：聚乙二醇、邻苯二甲酸二丁酯，均为分析纯试剂；分散剂：十二烷基硫酸钠、木质素磺酸钠，均为分析纯试剂；表面活性剂：吐温-80、脂肪醇聚氧乙烯醚、司盘-80、聚氧乙烯辛基苯酚醚-10，均为分析纯试剂；助悬剂：硬脂酸铝、二氧化硅、海藻酸钠、羧甲基纤维素，均为分析纯试剂。以上试剂均购于重庆铂锶钛科技有限公司。

仪器设备：UV-1750岛津紫外可见分光光度计，岛津（中国）有限公司；TDL-40B高速离心机，上海安亭科学仪器厂；SW-CJ-1D净化工作台，苏州净化设备有限公司；GZX-9070数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司设备厂；电冰箱，合肥荣事达电冰箱有限公司；SPX-150B-Z生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AUY120分析天平，岛津国际贸易公司；高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黄金针菇液体菌种的制备

1）黄金针菇液体菌种的培养

液体种子基础培养基为：葡萄糖15 g、酵母粉5 g、硫酸镁 0.5 g、磷酸二氢钾 0.5 g、磷酸氢二钾0.5 g，水 1 000 mL。

将培养好的斜面菌种切取蚕豆大小，接于液体培养基中，250 mL三角瓶装液量100 mL，温度25℃，150 r·min-1，摇床培养 3 d。

2）黄金针菇发酵菌丝体的制备

取发酵好的液体菌种，在超净工作台中用已灭菌的滤纸将发酵液过滤，得黄金针菇菌丝体，将获得的菌丝体转至无菌培养皿中，备用。

1.2.2 黄金针菇混悬菌种制剂的配制

取具塞且无菌的刻度试剂管（60 mL），于每支试管中加入已制备好的黄金针菇菌丝体（约5 g）和50 mL溶剂油（聚乙二醇和邻苯二甲酸二丁酯），再分别加入分散剂、表面活性剂和助悬剂，充分混匀，静置24 h，测定其沉降体积比。固液比的优化试验按此法配制即黄金针菇菌丝体（固体）称取m1（g），液体为试验中使用的溶剂油V1（mL），在后续试验中固液比 （体系） 表述为 m1∶V1（g∶mL）。

1.2.3 沉降体积比的测定

沉降体积比的测定：将上述制备好的各混悬剂置于刻度试管内，静置24 h后，分别测定其沉降体积比（S），公式为：

式中：H1为沉降后混悬液的高度（mm）；H0为沉降前混悬液的高度（mm）。

1.2.4 优化后的黄金针菇菌种制剂的配制

取具塞且无菌的刻度试剂管（60 mL），于每支试管中加入已制备好的黄金针菇发酵菌丝体30 g、聚乙二醇35 mL、邻苯二甲酸二丁酯15 mL，再分别加入十二烷基硫酸钠0.7 g，聚氧乙烯辛基苯酚醚-10约0.4 g，羧甲基纤维素0.6 g，充分混匀即得1个单位黄金针菇菌种制剂。

1.2.5 黄金针菇接种出菇试验

栽培方式为袋式熟料栽培，栽培菌袋规格17 cm ×33 cm×0.03 cm。

1） 菌袋制作

栽培配方为酒糟64%、棉籽壳15%、玉米芯15%、麦麸5%、石灰1%。按以上配方计算出具体的用量，称取新鲜、无霉变、无虫蛀、干净、干燥的原料。将称好的棉籽壳、玉米芯用水发透后。再将其他原料混入其中拌匀。栽培料的水分含量控制在65%～70%，以用手握一把料，指缝间有水滴渗出，但不滴下为宜。以石灰水调节pH至6.5左右，装料时松紧适宜，每袋装料约500 g。

将装好的菌袋分层码在灭菌灶内，袋与袋之间留2 cm的空隙，以便蒸汽流通，灭菌彻底。接好通气管后用高压灭菌方法灭菌6 h。

2）接种

当菌袋冷却至30℃时，将料袋和经75%酒精表面消毒的液体种瓶和清洗干净的接种工具，放入接种箱内，用优氯净消毒粉熏蒸0.5 h即可接种。将1.2.4中1） 所述制得的菌种制剂接种于栽培袋内，每袋栽培袋用2个单位菌剂。接种过程应尽可能缩短开袋时间，做到无菌操作，严格控制，减少污染。待接种完成后将菌包转移到已消毒的发菌室。

3） 发菌管理

把菌袋分层码在发菌室内，堆码高度为6层。袋与袋之间应留有适当空隙，以利于气体交换。发菌期温度控制在22℃～24℃为宜，空气湿度控制在70%以下。发菌期间结合温度、湿度情况进行通风换气，保持空气新鲜。待菌丝生长至过肩之后，可进行翻堆，将外缘的菌袋向内移动，里层的菌袋向外移动，以便菌丝的长势相对一致。同时剔出生长状态不良和被污染的菌袋。

4）出菇期管理

菌丝长满菌袋后便可搔菌，搔菌后，遂转至催蕾室继续培养，待菌包现原基后移至出菇房培养即可出菇。出菇期环境温度控制在温度6℃、湿度80%，每天打开通风口通风换气，保持空气新鲜。出菇阶段，保持栽培室内不要有强光照射，保证一定的散射光。光照强度控制在500 lx～2 000 lx。

5）采收

菌盖浅黄色至黄褐色，菌柄黄褐色；菌盖圆整，呈半球形，菌柄挺直；菌盖直径小于3 cm；菌柄长15 cm即可采收，称重，统计分析。

1.2.6 正交试验设计

根据单因素中4个因素的试验结果，取各因素的最优值作为中间水平进行L9（34）正交试验。各因素选取水平情况见表1。

表1 正交试验因素水平Tab.1 The factor level of orthogonal experiment

1.2.7 数据处理

每次试验所得数据均采取3次生物学重复后计算而来，采用SPSS 19.0软件进行统计数据的均值和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 溶剂油复配比例对菌剂质量的影响

影响混悬制剂质量的指标主要有分散性、流动性、沉降体积比、稳定性等[11]，其中《中国药典》2015版对混悬制剂质量的考察要求是沉降体积比，口服混悬剂的沉降体积比应不低于0.90[12]。各溶剂油的理化性质不同，其复配比例直接影响混悬菌剂的沉降体积比，进而影响菌剂的质量[13]。

对已筛选出的溶剂油聚乙二醇和邻苯二甲酸二丁酯进行配比研究，通过测定，聚乙二醇∶邻苯二甲酸二丁酯 （mL ∶mL） 为 0∶10、3∶7、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0 时，沉降体积比分别为 36%、48%、57%、68%、79%、70%、58%、40%。随着聚乙二醇含量的增加及邻苯二甲酸二丁酯含量逐渐减少，黄金针菇菌剂的沉降体积比呈现先增加后下降的趋势。为获得菌剂较优的沉降体积比，选定聚乙二醇∶邻苯二甲酸二丁酯为7∶3作为复合油溶剂。

2.2 黄金针菇菌剂固液比对菌剂质量的影响

在菌剂的体系中，固液比的不同影响菌体在体系中的分散程度，从而影响菌剂沉降体积比[14]。

通过测定，固液比为 5∶50、10∶50、15∶50、20∶50、25∶50、30∶50时，沉降体积比分别为38%、46%、57%、83%、90%、82%。随着固液比的增加，沉降体积比呈现增高的趋势；若固液比继续增大，由于菌丝体自身的重力及团聚现象，菌丝体将无法分散在溶剂油中，此时沉降体积比反而降低。因此，选择固液比为25∶50为佳。

2.3 助剂添加对菌剂质量的影响

目前，在生防菌剂研发领域，使用较多的助剂主要是分散剂、表面活性剂和助悬剂。分散剂的主要作用是防止菌体发生团聚现象，促进菌体均匀地分散在溶剂油体系中[15]；表面活性剂能显著降低溶液的表面张力或界面张力，并能改进溶液的增溶、乳化、分散、渗透、润湿等能力[16]；助悬剂主要是增加混悬剂中分散介质的粘度，从而降低微粒的沉降速度[17]。因此，为了进一步提高菌剂的质量，在上述优化试验的基础上，分别对分散剂种类（1个单位菌种制剂加入0.4 g）、表面活性剂种类（1个单位菌种制剂加入0.5 g） 和助悬剂种类（1个单位菌种制剂加入0.4 g）的添加进行考察，以清水为对照组，结果见表2。

表2 助剂添加种类对菌剂质量的影响Tab.2 Effect of kinds of auxiliaries on the quality of strain agent

从表2可知，不同的助剂添加对菌剂沉降体积比的影响不同，较好的分散剂是十二烷基硫酸钠，表面活性剂是聚氧乙烯辛基苯酚醚-10，助悬剂是羧甲基纤维素。

2.4 不同助剂浓度对菌剂质量的影响

在确定助剂种类的情况下，不同助剂添加量对菌剂质量的影响见表3。

表3 不同助剂浓度对菌剂质量的影响Tab.3 Effects of different concentrations of auxiliaries on the quality of strain agents

由表3可知，随着分散剂添加量的增加，沉降体积比呈现先增加后下降的趋势；随着表面活性剂的用量增大，沉降体积比呈现先增加后趋稳；随着助悬剂的加入，沉降体积比亦呈现先增加后下降的趋势。因此，分别选择十二烷基硫酸钠用量为0.7 g，聚氧乙烯辛基苯酚醚-10用量为0.7 g，羧甲基纤维素用量为0.6 g用于后续试验。

2.5 正交试验结果

根据上述单因素试验结果，对固液比、十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯辛基苯酚醚-10及羧甲基纤维素4个因素进行正交试验优化。正交试验结果及分析见表4。

表4 正交试验设计及结果分析Tab.4 The orthogonal experiment design and results

由表4可知，表面活性剂聚氧乙烯辛基苯酚醚-10是影响黄金针菇菌剂分散及沉降体积比的最显著因素，其余3个因素的显著性影响程度依次是羧甲基纤维素＞固液比＞十二烷基硫酸钠。4个试验因素的最佳培养组合为：A3B2C1D2，即固液比为30∶50，十二烷基硫酸钠添加量为0.7 g，聚氧乙烯辛基苯酚醚-10添加量为0.4 g，羧甲基纤维素添加量为0.6 g。按优化后的条件制备黄金针菇菌种制剂并接种于出菇用菌包内，各组的鲜菇产量统计见表5。

由表5可知，接种黄金针混悬菌种制剂的菌包平均产量为545.33 g，对照组平均产量为541.67 g。经统计分析表明两者无显著差异（P＞0.05），表明本试验研制的黄金针菇混悬菌种制剂产菇效果与工厂化的相当，可用于生产实践。

表5 不同菌剂出菇对比试验Tab.5 Comparative experiment on mushroom emergence with different microbial inoculum

3 讨论

目前，微生物菌剂主要是将真菌的菌丝体或孢子配制成水悬液、粉剂等剂型[14-18]，应用于农业生产。在植物病虫害防治方面，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、苏云金芽胞杆菌 （Bacillus thuringiensis）等制剂主要用于对松毛虫、青虫等害虫的防控[23]；木霉菌（Trichoderma spp.）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis） 等生防菌剂用于对植物病害的防治[24-25]。在食用菌生产种的制备领域，主要采用固体菌种或液体菌种用于生产菌包的接种，食用菌固体菌种便于运输，污染率低，菌棒或菌袋被污染后可迅速清理，不会导致多规模的污染，受到广大菇农的青睐，但需要投入较多的人力和设备[26]。食用菌液体菌种具有菌丝菌龄较一致、生长速度快、纯度高、活力强、成本较低的特点[27]，但液体菌剂在制作过程中对设备的要求较高，液体菌种的获得需要发酵系统、灭菌系统、空气压缩机、空气净化系统等，对设备运行、维护的要求较高。

重庆18个贫困乡镇所分布的地区以山地丘陵为主，气候适宜食用菌的生长，但基础设施建设落后，产业基础薄弱，造成该区域内长期以来面临产业空心化等问题。因食用菌具有不争农时、不争肥、占地少、周期短、投资小、见效快等特点，已成为各贫困地区脱贫的主导产业，为解决贫困山区黄金针菇产业发展中生产用菌种的供应问题，在掌握黄金针菇菌丝体的生物学特性和栽培特性的基础上，通过正交试验，确定了制备黄金针菇混悬菌种制剂的最优培养条件：固液比为30∶50，十二烷基硫酸钠添加量为0.7 g，聚氧乙烯辛基苯酚醚-10添加量为0.4 g，羧甲基纤维素添加量为0.6 g。经检测混悬制剂沉降体积比为95%，达到2015版《中国药典》对混悬制剂的检测要求，制备的混悬菌种制剂菌丝体分散均匀、稳定性好、不易沉降。此外，采用混悬菌种制剂接种的菌包黄金针菇平均产量为545.33 g，与接种液体菌种培养的黄金针菇产量（541.67 g）相当，表明该混悬菌种制剂可运用于山区分散式扶贫产业的推广，可有效解决贫困山区农户菌剂来源的问题，为食（药）用菌新型菌种制剂的研制及扶贫产业模式的推广提供了借鉴。