ARTP诱变技术选育黑木耳优良发酵菌株初探*

王 晨，马欣欣，平琳琳，王 谦

（河北大学 生命科学院，河北 保定 071000）

当前食（药）用真菌与发酵工业的交叉，成为食用菌行业进步的标志之一。液体菌种具有培养周期短、不受季节限制、利于规模化、接种方便、菌丝体生长一致等优势[1-2]，液体培养的方式能够有效提高菌类产量和效益，而且在现代农业中的黑木耳产业，液体菌种的应用已经成为产业常态。与此同时，对于其液体发酵过程中产生的次生代谢产物如黄酮、多酚、多糖等[3-6]的应用也愈发受到重视，良种选育已经成为发酵工业重要的应用基础研究领域。黑木耳（Auricularia auriculae）作为我国食用菌产量排名第二的菌类，不仅口味鲜美而且营养丰富，还具有抗癌、降血脂、提高免疫力等作用[7]。目前食（药）用菌一般采用孢子分离、杂交育种、紫外诱变等育种方法，近年来出现的ARTP诱变技术育种[8]，在黑木耳育种研究中尚无报道。本试验探究了ARTP育种技术在选育发酵性状优良的黑木耳细胞工程菌株方向的应用，并对其在发酵、液体菌种应用、多糖含量等方面开展了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

供试菌株：出发菌株为黑木耳黑威半筋品种，黑龙江微生物研究所提供；细胞工程菌株：Aa66、Aa98、Aa101、Aa285。以上菌株均保存于河北大学食药用真菌研究所。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯（去皮） 20.0%、葡萄糖2.0%、麸皮 2.0%、琼脂 2.0%、KH2PO40.1%、Mg－SO40.1%，pH自然。

液体发酵培养基：葡萄糖2.5%、玉米粉0.5%、豆粕粉0.5%、MgSO40.1%、酵母膏0.2%、KH2PO40.2%，pH自然。

1.2 ARTP诱变育种技术选育黑木耳细胞工程菌株

1.2.1 菌丝体的制备

按液体发酵培养基配方进行配制，500 mL三角瓶中装液量200 mL，通过无菌操作对活化后的PDA斜面黑木耳菌种进行接种[9]，并于28℃、160 r·min-1恒温振荡培养5 d[10]，获得黑木耳菌丝体。

1.2.2 菌悬液的制备

在超净工作台上，将制备好的黑木耳菌丝体发酵液经80目铜丝网过滤，滤液经移液枪取10 mL至离心管中，8 000 r·min-1离心5 min后弃上清，无菌水冲洗沉淀2次，再次离心后加入无菌水，摇匀后得菌悬液[11]。

1.2.3 ARTP诱变处理

在超净工作台中，用移液枪吸取10 μL菌悬液悬浮于载片上，并放入ARTP诱变仪操作仓中，将各参数分别设置为标准大气压下气流量10 L·min-1、输出功率100 W、辐射距离2 mm[12]，诱变时间梯度为 0、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s、35 s、40 s、45 s、50 s，在每个时间点设置3个平行样品，0为对照组。将经过诱变处理后的载片夹放于装有1 mL无菌水的EP管中，置于涡旋振荡器上混合均匀，再用移液枪吸取300 μL液体涂布于再生培养基平板，封口膜密封后恒温避光培养5 d～7 d，记录再生菌株数，得到致死率曲线，并确定最佳诱变照射时间。

重复试验，获得大量黑木耳诱变菌株后，挑取再生培养基中长势较好的菌株转接于PDA培养基上，并进行标号记录。

1.2.4 再生菌株的筛选

将经ARTP诱变所获得的再生菌株以出发菌株黑威半筋为对照菌株，进行拮抗试验[13]。选择有明显拮抗反应的再生菌种进行复筛试验，包括萌发定植对比试验[14]、生长速度和长势对比试验、营养生长酶活[15-19]对比试验。

1.2.5 优良菌种的真实性鉴定

经初筛与复筛后，参考中国农业行业标准NY/T 1730-2009食用菌菌种真实性鉴定ISSR法[20]，选择性状优良的再生菌株与出发株采用ISSR分子标记技术进行菌种真实性鉴定，确定其分子水平上的遗传距离。

1.3 黑木耳细胞工程株发酵性能对比

1.3.1 发酵培养

按液体发酵培养基配方进行配制，250 mL三角瓶中装液量100 mL，将PDA菌种以8%的接种量[10]转接于制备好的液体发酵培养基中，并于28℃、160 r·min-1恒温振荡培养[10]，进入摇床的第1天定时、定瓶（每隔8 h，每个菌种各3瓶） 取100 mL发酵全液进行各项指标检测，并求平均值。

1.3.2 指标数值检测

采用菌丝鲜重评价生物量[21]；采用手持糖度计法测定残糖量[22]；采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[23]。

1.4 发酵菌种的生理指标检测

经上述探究后，对较优菌株进行发酵液pH[22]、氨基氮含量[24]、羧甲基纤维素酶、漆酶、半纤维素酶[15-19]等生理活性指标的检测。

1.5 数据处理

数据采用SPSS软件进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 ARTP诱变育种试验结果

ARTP诱变菌丝体致死曲线见图1。

图1 ARTP诱变致死曲线Fig.1 Lethal curve of ARTP mutation

由图1可知，在40 s时菌丝体的致死率为82.16%；45 s时菌丝体的致死率为91.08%；50 s时菌丝体的致死率为99.06%；55 s后致死率达到了100%。因此选用45 s为ARTP最佳诱变时间。

重复进行ARTP诱变试验，共获得285株长势良好的再生菌株，依次编号为 Aa1、Aa2、Aa3、Aa4、……Aa285。

2.2 再生菌株初筛结果

通过ARTP诱变得到的285株再生菌株与出发菌株进行拮抗试验后，共有36株与出发菌株产生明显的拮抗反应，突变率为12.6%。

2.3 再生菌株复筛结果

经萌发定植对比试验、生长速度和长势对比试验，对36株再生菌株进行比较，有23株生长较慢，菌丝较为稀疏，菌丝体较弱而淘汰。余下菌株筛选后有6株明显优于出发株，其生长情况对比见表1。

表1 6株再生菌株生长情况对比Tab.1 Growth comparison of 6 regenerated strains

由表1可知，Aa229表现较差，在萌发时间与菌丝生长速度上均弱于出发株黑威半筋，Aa278、Aa285表现与出发株较为接近，而Aa66、Aa98、Aa101表现较好，且与出发株黑威半筋存在极显著性差异。6株再生菌株营养生殖阶段的多酚氧化酶、漆酶、羧甲基纤维素酶酶活的对比情况见表2。

表2 6株再生菌株酶活性对比Tab.2 Comparison of enzyme activities of 6 regenerated strains

由表2可知，6株再生株在3中酶的活性测定中存在差异。综合比较而言，Aa229、Aa278表现较差；其余4株菌株强于出发株黑威半筋、Aa66、Aa98、Aa101、Aa285明显与出发株具有显著性与极显著性差异；Aa66在3种酶的测定中表现最优，且与出发株存在极显著性差异。

2.4 菌株真实性鉴定结果

对筛选出的4株优良菌株与出发株进行ISSRPCR扩增，其扩增图谱见图2。

图2 部分引物对5个菌株的ISSR扩增图谱Fig.2 ISSR amplification map of 5 strains by partial primers

由图2可知，在随机挑选的30条引物中，共有10条引物的扩增图谱效果较好，稳定合理且具有差异性。共获得了42条扩增条带，每条引物可获得2条～5条扩增条带，其中有27条扩增条带与出发株黑威半筋有差异，扩增条带大小在150 bp～2 000 bp内。采用Ntsys 2.10e对4株优良再生菌株以及出发菌株的遗传相似系数进行聚类分析，所构建遗传关系聚类树形图见图3。

图3 优良再生株与出发株遗传关系聚类树状图Fig.3 Dendrogram of genetic relationship between excellent regenerated plant and original plant

由图3可知，4株优良再生菌株与黑威半筋的变异范围为0.650～0.880，表明4株优良再生株均与出发株存在稳定性差异。

2.5 液体发酵过程中生物量的变化

5株黑木耳菌株在液体培养过程中菌丝体鲜重变化结果见图4。

图4 5株黑木耳菌株在液体培养过程中菌丝体鲜重变化结果Fig.4 Changes of mycelial fresh weight of 5 strains of Auricularia auricula during liquid culture

由图4可以得出，随培养时间的增长，各菌株生物量均呈明显上升趋势。其中，4株优良再生株最高生物量均高于出发株，但Aa285与其相差极小。观察曲线走势可看出，Aa101进入增殖生长期时间较晚，且与其他3株细胞工程株相差较大。综合比较而言，Aa66与Aa98表现较为优良，均在48 h时进入增值生长期，但Aa66较快的进入稳定期，在136 h时生物量达到最大值32.96 g·100-1mL-1，明显高于Aa98，更具有优势。

2.6 液体发酵培养中残糖量的变化

5株黑木耳菌株液体培养过程中发酵液内残糖的变化结果见图5。

图5 5株黑木耳菌株在液体培养过程中发酵液中残糖的变化结果Fig.5 Changes of residual sugar in fermentation broth of 5 strains of Auricularia auricula during liquid culture

由图5可以得出，随培养时间的增长，各菌株发酵液的残糖度均呈明显下降趋势，且与生物量的变化时间节点基本一致，这表明在菌丝生长的同时，会大量消耗碳源。对于碳源的分解能力依次为Aa66＞Aa98＞Aa101＞黑威半筋＞Aa285。

2.7 发酵液总多糖测定结果

5株黑木耳菌株发酵液多糖测定结果见表3。

表3 5株黑木耳菌株发酵液多糖测定结果Tab.3 Determination results of polysaccharides in fermented mash of 5 Auricularia auricular strains

在发酵培养过程中生物量达到最大时，取100 mL发酵液，经匀质机机械破碎，进行发酵液总多糖含量的测定，4株再生菌株多糖量均高于出发株，其中Aa66、Aa98与出发株相比有极显著差异，其中Aa66最佳。

2.8 再生株Aa66的生理指标检测结果

2.8.1 pH变化

再生株Aa66发酵过程中pH的变化情况见图6。

图6 pH变化情况Fig.6 Change of pH

如图6所示，随着发酵的进行，发酵液pH先下降后升高，但变化范围较小，基本在5.5～7.4之间波动。

2.8.2 氨基氮含量测定结果

再生株Aa66发酵过程中氨基氮含量变化情况见图7。

图7 氨基氮含量变化Fig.7 Change of amino nitrogen content

如图7所示，氨基氮含量随发酵时间的上升呈增加趋势，0～48 h时增加缓慢，48 h后增加较快。在160 h后，随着生物量的下降，氨基氮含量呈上升趋势，这表明在培养后期菌丝老化，发生菌球自溶现象，结构性蛋白快速分解，使得发酵液中氨基氮含量增多。

2.8.3 还原糖含量

再生株Aa66发酵过程中还原糖含量变化情况见图8。

图8 还原糖含量变化Fig.8 Change of reducing sugar content

如图8所示，随着发酵的进行，还原糖含量呈先增加后下降的趋势，在迟缓期与对数生长期还原糖含量增加，表明在发酵初期菌丝体分解碳源能力较强，还原糖的生成量远大于消耗量，在120 h时，达到最大值76.66 mg·100-1mL-1。在对数生长期后期以及进入稳定期后，菌丝体大量生长，对于碳源的消耗能力进一步提高，还原糖含量下降。

2.8.4 酶活性测定结果

再生株Aa66发酵过程中3种酶活性变化情况见图9。

图9 酶活性变化Fig.9 Changes of enzyme activity

如图9所示，在发酵培养过程中，3种酶活性均先增高后下降。羧甲基纤维素酶活性变化明显，在0～48 h几乎没有变化，48 h后开始增加，96 h后快速上升，在136 h时达到最大值70.01 U·mL-1。而半纤维素酶与漆酶酶活性变化较小，半纤维素酶酶活性在144 h时达到最大值4.92 U·mL-1，漆酶酶活在120 h时达到最大值7.94 U·mL-1。在对数生长期，菌丝体生长迅速，需要较多的养分，因此产生大量的酶进行基质的分解，酶活性也随之升高。当进入稳定期，菌丝体产生大量次生代谢产物，此时对于养分需求逐步下降，导致酶的活力下降。由于酶易失活的特性，使其在后期呈直线下降。

3 讨论

ARTP诱变育种作为一种微生物育种新技术，在细菌、放线菌、酵母菌上已有应用，在食（药）用真菌领域的应用较少，而在黑木耳的诱变育种试验中尚未报道。通过ARTP诱变育种技术，以黑威半筋为出发株，共获得285株再生菌株，经一系列筛选试验后，共获得4株性状优良的再生株。通过液体发酵试验，对比其发酵性能，通过生物量、分解碳源的能力、多糖产量为指标，确定最适发酵菌株为Aa66。后续试验需要对Aa66菌株发酵的过程进行一系列生理指标的检测，为Aa66菌株在生产上的应用奠定基础。

在当前食用菌的发酵产业中，液体发酵工艺已取得规模性进展，菌种作为生产的第一要素，对食用菌产量与质量起决定性因素。细胞工程菌株Aa66是否可用于工业化生产，以及其在工业生产中实际的发酵性能，仍有待进一步探究。