人工合成板栗与点柄黏盖牛肝菌的外生菌根初步研究*

朱姝蕊，冀瑞卿，李 玉**

（1.丽水职业技术学院，浙江 丽水 323000；2.吉林农业大学，吉林 长春 130000）

菌根是生物界中最广泛及最重要的一类共生体，其中外生菌根在森林生态系统中发挥着重要的作用[1]，其能扩大树木根系的吸收面积和吸收范围，增强共生树木对营养元素的吸收和利用[2]，提高共生植物的抗逆性和抗病性[3]，增强树木生长能力和提高造林的成活率，改良土壤和提高土壤生产力，促进真菌与植物间的物质交换，能量流动和信息传递等[4]。外生菌根资源丰富，1982年Miller统计出世界上己知有34个科、90个属、约5 000种真菌形成外生菌根[5]，随着分子生物学在菌根领域的应用，2005年Taylor and Alexander重新预估了外生菌根真菌的种类数量，其数量可能为 7 000～10 000种[6]。真菌能与山毛榉科植物中的板栗形外生菌根早已得到证实，并已有诸多研究[7-8]。

板栗（Castanea mollissima） 又名栗、中国板栗，属双子叶植物纲（Magnoliopsida） 山毛榉目（Fagales） 山毛榉科（Fagaceae） 栗属（Castanea），广泛分布于中国、越南、欧美等地区，现已可人工栽培。1995年秦岭等[8]对燕山山脉板栗林下菌根资源研究显示，与板栗共生的外生菌根真菌约有13属、29种，由此可见板栗的菌根资源十分丰富。除野外资源调查外，对板栗外生菌根在室内合成的研究也有少量报道，2009年耿立英[9]利用印度块菌（Tuber indicum）合成板栗菌根，并对形态进行了详细描述；2012年池彦涛[10]以美味牛肝菌（Boletus edulis） 和褐环乳牛肝菌（Suillus luteus）为菌剂，测定接种处理后的板栗幼苗生理指标，结果显示在缺铁胁迫环境下，外生菌根的合成能够促进板栗苗株高和地径的增长，有效地促进叶绿素的积累，但对菌根合成方法和菌根形态的描述未有详细阐述。

点柄黏盖牛肝菌 [Suillus granulatus(L.:Fr.)O.Kuntce]，属于担子菌门（Basidiomycota） 伞菌亚门（Agaricomycotina） 伞菌纲 （Agricomycetes） 伞菌亚纲（Agaricomycetidae） 牛肝菌目（Boletales） 牛肝菌科（Suillaceae） 乳牛肝菌属（Suillus），是一种名贵的可食用外生菌根真菌，具有菌肉肥厚、味道鲜美、营养价值丰富等特点，受到人们的青睐，是我国东北地区野生食用菌进出口贸易的重要品种，但目前无法人工栽培。

菌根是形成外生菌根菌真菌子实体的前提，要研究点柄黏盖牛肝菌的人工栽培技术，需从人工合成外生菌根入手，但至今尚未有对此菌与板栗合成外生菌根的报道。因此，选择点柄黏盖牛肝菌与板栗为研究对象，对其人工合成外生菌根进行初步的研究与探讨，为点柄黏盖牛肝菌人工栽培技术提供前期理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 板栗种子处理

板栗种子，购自吉林省长春市种子资源市场；用清水清理洗涤，去除杂质。用1%的高锰酸钾表面消毒，浸泡4 h～5 h；后用无菌水洗涤至水无色，盛放在铺满脱脂棉的培养盘中，放置于25℃培养箱2 d，间隔12 h浇无菌水，直至种子萌发裂口。

1.1.2 真菌培养与菌剂制备

点柄黏盖牛肝菌菌种，来源于吉林省蛟河国家级重点公益林区野外分离。选用PDA固体培养基[11]，温度28℃，湿度70%～75%，避光培养30 d～35 d。将长满平板中的菌丝与培养基分离，用无菌水洗涤3次。1 L无菌水中加入菌丝40 g，用搅拌机搅碎30 s制成菌剂，待用[12]。

1.1.3 培养基质配比与处理

培养基质由珍珠岩、蛭石、草炭土3种材料混合，体积比为1∶4∶5[4]，混合均匀后，121℃高温灭菌2 h，达到相对无菌状态。培养选用聚乙烯培养盆和培养钵，体积分别为60 cm×40 cm×60 cm和30 cm×20 cm，使用前用75%乙醇浸泡消毒。

1.2 试验方法

1.2.1 板栗接种菌剂

板栗种子根据1.1.1的方法处理完，至种子口开裂后，播种于装满无菌培养基质的培养盆中，置于培养室内，湿度60%～75%，温度20℃～25℃，间隔7 d浇水1次，根据时节，调整供水量，保证苗木正常生长即可，栽培1年。满1年后，将苗木移栽，移栽过程中，将板栗根系外围侧根简略处理，沾菌剂，在新培养钵中填满2/3培养基质，后将处理好的苗木放置其中，再倒入100 mL菌丝悬液，覆土填满培养钵。培养初期，保持培养室与土壤的微干旱环境，约7 d后，补接菌剂，用菌剂浇灌苗木。后以10 d为一个周期，以水浇灌苗木，栽培3月后，观察板栗根系情况。

1.2.2 观察菌根形态

取菌剂培养3月后的板栗新鲜菌根根尖20个，固定于FAA酒精醋酸福尔马林混合固定液中，制成菌根石蜡切片，用番红和固绿2种染料复染。用MOTIC SMZ-140解剖镜和显微镜，观察点柄黏盖牛肝菌与板栗形成菌根的形态结构，并测量拍照。

1.2.3 验证菌根来源

为证实所观察菌根是否由点柄黏盖牛肝菌与板栗所形成，提取菌根共生体的DNA，采用分子手段验证试验结果。

1） DNA提取

采用CTAB法，提取总DNA。选取约100 mg新鲜菌根，用75%的乙醇浸泡消毒3 min，后用1%的升汞浸泡60 s。用无菌滤纸吸干，置于干冷研钵中，加入液氮和石英砂，快速研磨，至粉末状，加入65℃预热好的4×CTAB 700 μL，充分混匀，在65℃水浴锅中培养30 min～60 min，间隔15 min摇晃1次；再加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比为24∶1），充分混匀后，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液。如上清液较浑浊，再次加入氯仿-异戊醇洗涤，至上清液清澈。加入等体积的异丙醇，室温沉淀10 min，最大速度离心10 min，倒上清，用70%乙醇洗涤 3 次，37℃烘箱烘干 5 min，后加入 40 μL～60 μL TE缓冲溶液，可即溶。-20℃中保存，待用。

2） PCR扩增与检测

PCR 扩增采用 25 μL 体系，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 U，ddH2O 17 μL，DNA 模板 1 μL。扩增反应在 eppendorf PCR仪中进行，扩增反应程序热循环参数为94℃变性 85 s。1～13循环 95℃变性 35 s，55℃退火55 s，72℃延伸 45 s；14～26 循环 95℃变性 35 s，55℃退火 55 s，72℃延伸 120 s；27～35循环 95℃变性35 s，55℃退火55 s，72℃延伸180 s；循环结束后72℃再延伸10 min，一共进行35个循环。PCR所 用 引物 为 ITS1-F（5’-CTTGGTCATTTTAGAGAAGGTAA-3’）、ITS4-B （5’-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3’），所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测[13]，后移送上海生工生物有限公司进行序列。

2 结果与分析

2.1 菌根形态特征

菌根形态结构特征见图1。

图1 菌根形态结构Fag.1 The morphological structure of Castanea mollissima ectomycorrhiza

由图1所示，板栗根系接种点柄黏盖牛肝菌菌剂3个月后形成菌根，通过显微镜对形成菌根进行宏观形态观察发现，新鲜菌根顶部与基部颜色较深，呈暗黄褐色，其余部分颜色大多呈淡黄色。菌根形态呈棒状、羽状和珊瑚状，具0～1级次生分枝，主要为单轴、二叉分支。菌根顶端多膨大粗壮，基部无明显变大现象，末级分枝顶端顿圆，整体有弯曲状、棍棒状，圆柱状等多种形态。菌根最长可达18.5 μm，直径19.23 μm；菌根表面不光滑，外延菌丝明显且丰富，纤细直线形，呈绒毛状，亮白色，菌套明显，细胞略透明；未见菌索与菌核。菌根形态结构测量结果见表1，其菌根横切面见图2。

表1 板栗-点柄黏盖牛肝菌菌根形态结构测量值Tab.1 Characteristics of ectomycorrhiza of Suillus granulatus and Castanea mollissima

图2 板栗菌根横切面Fig.2 Horizontal section of Castanea mollissima ectomycorrhiza

如图2所示，菌根横切面根部细胞外围有致密的菌丝层包被，菌套层较厚，排列紧密，菌套横截面厚0.45 μm～1.00 μm，并向内在细胞间隙中延伸，明显形成哈蒂氏网。

2.2 分子验证结果

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果见图3。图3中M为中科瑞泰生物有限公司提供的D2000 DNA Ladder已知核酸标记物，1为板栗叶片样本，2为点柄黏盖牛肝菌菌丝体，3为板栗菌根共生体。

由图3可知，2和3的DNA片段大小为750 bp～1 000 bp，且此产物经测序后，与NCBI序列号为HQ 439177.1的点柄乳牛肝菌（S.granulatus） 的相似比为99%。由此得出，该板栗菌根确实是由点柄黏盖牛肝菌与板栗共生形成。

图3 PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Intensities of the amplified DNA in the ITS region from Castanea mollissima ectomycorrhiza

3 讨论

对于人工合成点柄黏盖牛肝菌菌根的研究较少，2005年Kataoka等[14]研究了地中海白松与点柄黏盖牛肝菌菌根的合成，但选用了荧光假单胞杆菌辅助。关于合成板栗菌根的研究，国内外以块菌属（Tuber）居多，尚未有关于点柄黏盖牛肝菌的报道。在人工合成菌根结果中，点柄黏盖牛肝菌与印度块菌相比，菌根纤弱，颜色深暗，尤其是有许多羽状及珊瑚状分枝，未见塔状分枝。产生此差异的原因可能与接菌剂类型相关，块菌属、牛肝菌属与阔叶树木形成的菌根形态有所差异。本次试验对人工合成板栗与点柄黏盖牛肝菌外生菌根形态做了初步的描述与鉴定，为后续研究提供理论基础；接种菌剂的计量、形态、合成培养时间等还待进一步研究与探讨。