UPLC 法测定维C 银翘片中6 种有效成分的含量

周亚菁，沈于兰

无锡市药品安全检验检测中心，无锡 214028

维C 银翘片是由山银花、连翘、牛蒡子、甘草等10 味中药加入对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏、维生素C 等3 种化学药加工而成的复方制剂[1]，本品临床主要用于治疗流行性感冒引起的发热、头疼、咳嗽、口干、咽喉疼痛等症[2]。《中国药典》2015 年版对维C银翘片质量标准中分别采用高效液相色谱（HPLC）法测定绿原酸、牛蒡苷、维生素C、对乙酰氨基酚、马来酸氯苯那敏含量，其测定的5 种成分采用几种不同的流动相系统分别检测，实际操作繁琐、工作效率低[3]，且未对甘草和连翘两味中药进行质量控制。

目前尚未有文献报道采用UPLC 法同时测定维C 银翘片中的多种成分。现采用UPLC 梯度洗脱，同时测定维C 银翘片中6 种成分（维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷）的含量，与药典方法相比，少了马来酸氯苯那敏的测定，增加了连翘苷、牛蒡苷的测定，优化了质量控制方法。

1 仪器与药品、试剂

UPLC（美国Waters 公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

样品：市售维C 银翘片：（厂家A：批号：C20180723、厂家B：批号：181032、厂家C：批号：180356）；规格：每片含维生素C 49.5 mg、对乙酰氨基酚105 mg、马来酸氯苯那敏1.05 mg。

对照品：维生素C（批号：100425-201504，纯度：100%）、对乙酰氨基酚（批号：100018-201610，纯度：99.9%）、绿原酸（批号：110753-201817，纯度：96.8%）、甘草苷（批号：111610-201908，纯度：95.0%）、连翘苷（批号：110821-201816，纯度：95.1%）、牛蒡苷（批号：110819-201812，纯度：95.0%），均购于中国食品药品检定研究院。

乙腈、甲酸为色谱级；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱柱：Thermo BDS Hypersil C18（4.6 mm ×100 mm，3.0 μm）；流动相：水（A），0.1%甲酸－乙腈（B），梯度洗脱：0～8 min、2%～15%B，8～25 min、15%～30%B，25～40 min、30%～5%B，40～45 min、5%～2%B；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；流速：0.2 mL·min-1；进样量：2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液分别精密称取绿原酸对照品10.416 mg，置5 mL 量瓶中；甘草苷对照品4.872 mg，置50mL 量瓶中；连翘苷对照品17.962mg，置100mL量瓶中；牛蒡苷对照品18.240 mg，置5 mL 量瓶中；分别加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的对照品贮备液。

精密称取维生素C 对照品68.84 mg，对乙酰氨基酚对照品155.14 mg，再精密加入绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷对照品贮备液各2 mL 置同一20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为维生素C 3.442 mg·mL-1、对乙酰氨基酚7.749 mg·mL-1、绿原酸0.202 mg·mL-1、甘草苷0.00926 mg·mL-1、连翘苷0.0171 mg·mL-1、牛蒡苷0.347 mg·mL-1的混合对照品贮备液。

精密量取混合对照品贮备液5.0 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液取同一批号的维C 银翘片（厂家A：批号：C20180723）20 片，除去包衣，研细，精密称取细粉约0.25 g，置15 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声振荡30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3 结果

2.3.1 系统适用性试验及专属性考察分别精密量取混合对照品溶液、供试品溶液和单一对照品溶液各2 μL，在“2.1”色谱条件下，分别注入液相色谱仪。

以供试品溶液作为系统适用性溶液，结果表明，维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷6 个成分峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，达到基线分离。理论塔板数按维生素C 峰和牛蒡苷峰计算均不低于8000。

供试品溶液在与6 种对照品色谱相应位置上出现一一对应的色谱峰，相应的DAD 谱图一致，表明方法专属性良好。见图1。

2.3.2 线性关系考察分别精密量取“2.2”项下混合对照品贮备液0.5、1.0、2.0、5.0、7.0 mL，置10 mL量瓶中，制成标准系列溶液，按“2.1”色谱条件进样测定，以峰面积（Y）和浓度（X，μg·mL-1）作线性回归，得线性方程和相关系数，见表1。6 种成分在各自浓度范围内线性关系良好。

图1 （A）混合对照品溶液、（B）供试品溶液UPLC 色谱图

2.3.3 检测限和定量限以信噪比（S/N）3 作为检测限（LOD），信噪比（S/N）10 作为定量限（LOQ），取“2.2.1”项下制备的对照品储备液，用甲醇稀释不同比例后进样测定6 种成分的检测限和定量限。见表1。

表1 6 种成分的线性方程、相关系数、线性范围、检测限、定量限结果

2.3.4 进样精密度试验精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积，计算RSD（n=6）。维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的峰面积的RSD 分别为1.3%、0.8%、1.0%、0.7%、1.3%、0.9%。表明仪器精密度良好。

2.3.5 重复性试验取同一批号的维C 银翘片（厂家A：批号：C20180723），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行6 份。按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，按外标法计算各成分含量。计算得维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的平均含量分别为51.78、106.08、1.95、0.098、0.23、4.17 mg·片-1，RSD（n=6）分别为0.5%、1.0%、0.3%、1.1%、1.8%、1.0%，表明方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验取同一批号的维C 银翘片（厂家A：批号：C20180723），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 h 测定。维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的峰面积的RSD（n=5）分别为0.9%、0.8%、1.3%、1.1%、1.5%、1.3%。表明6 种成分在室温放置12 h 均稳定。

2.3.7 回收率试验精密称取已知各成分含量的维C 银翘片（厂家A：批号：C20180723）细粉约0.125 g，置15 mL 量瓶中，分别精密加入已知浓度的对照品贮备液（维生素C 2.180 mg·mL-1、对乙酰氨基酚4.391 mg·mL-1、绿原酸0.0807 mg·mL-1、甘草苷0.00463 mg·mL-1、连翘苷0.00855 mg·mL-1、牛蒡苷0.173 mg·mL-1）高、中、低浓度各9、7.5、6 mL，每个浓度各3 份，按“2.1 项”下色谱条件进样测定，记录峰面积，代入标准曲线得各成分的含量，计算回收率，维生素C、对乙酰氨基酚、绿原酸、甘草苷、连翘苷、牛蒡苷的平均回收率依次为99.3536%、98.7488%、97.0363%、93.5348%、101.5961%、96.2097%。

2.3.8 样品测定取样品3 批，按“2.2”项下制备供试品溶液，分别将混合对照品溶液和供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。按外标法计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

因为维C 银翘片中所测6 种成分极性差异较大，为了达到同时分析的效果，在190～400 nm 内进行全波长扫描，综合分析各成分的最大吸收波长，最终选取280 nm 作为检测波长。在此波长下6 种成分均具有较好的色谱吸收，且在样品中与相邻的色谱峰可以达到良好基线分离，符合含量检测的要求。

3.2 供试品制备方法的选择

综合考虑所测6 种成分的理化特性[4]，它们在水中的溶解度均较小，易溶于甲醇，分别考察了50%甲醇、80%甲醇和纯甲醇溶解稀释样品，并考察不同超声时间（30、45、60 min）的提取效果。结果发现，用纯甲醇提取样品，超声处理30 min，各组分色谱分离度良好，能保证各成分提取完全，干扰少。

3.3 与《中国药典》2015 年版方法的比较

在《中国药典》2015 年版一部中规定：每片含绿原酸、牛蒡苷分别应不得少于1.5 mg、2.5 mg；所含维生素C、对乙酰氨基酚应为标示量的90%～110%。采用此药典方法检测维C 银翘片，结果见表3。

表3 《中国药典》方法结果

对比表2 所测4 种成分结果，本法与药典法的4 种成分的含量测定结果基本一致。

4 小 结

建立了UPLC 法测定维C 银翘片中多指标成分的含量，解决了HPLC 法分析时间长、耗用试剂量大的缺点，操作简便、有机溶剂消耗少、灵敏度高、重现性好，对维C 银翘片的质量控制方法作了优化。