离子色谱法测定口服电解质颗粒中阴、阳离子的含量

张建茹，昝艳楠，2，丁逸梅，2*

1 南京工业大学 药学院，南京 211800；2 江苏省药物研究所，南京 211800

人体的电解质大部分存在于细胞内外，保持着人体的平衡，电解质参与体内许多重要的功能和代谢活动，对维持正常生命活动起着重要的作用。本文中的口服电解质颗粒原研厂家为日本味之素株式会社，目前国内没有上市。本品为氯化钠、氯化钾、无水磷酸二氢钠、柠檬酸钠水合物、碳酸镁、水合柠檬酸、香料、乙基香草醛、香兰素、丙二醇等组成的颗粒，用于补充身体所需的离子。

氯离子、磷酸根离子及柠檬酸根离子的常规含量测定方法有电位滴定法[1]、高效液相色谱法[2]、气相色谱法[3]、离子色谱[4，5]等。电位滴定法每次只能测定一种离子，消耗时间长且测定要求较高（需要相应的专用电极）；而柠檬酸根在高效液相中保留较弱，检测器灵敏度低；而用气相色谱法测定需衍生化等过程，操作复杂。使用离子色谱法可同时测定多种离子，且制备样品简单。有报道采用离子色谱法进行柠檬酸测定[6]，由于柠檬酸是弱有机酸，在离子色谱柱上保留较强，常用梯度洗脱方式与其他常见阴离子进行分离，但分析时间较长，对设备配置要求高。

目前钠、钾、镁的测定方法主要有原子吸收法[3，4]、电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-MS）[5]、滴定法[6]、电极法[7]、离子色谱法等。原子吸收法测定金属时要进行预处理，加入消电离剂、释放剂等，且每次只能分析一种元素。滴定法和电位法操作较为繁琐，灵敏度不高，会造成二次污染，且当多种元素同时存在时，滴定法无法同时区分。ICP-MS 虽然灵敏度高，分析速度快，但其使用和维护成本比较高，仪器不够普及，并且不能直接进样进行分析[8]。

本文建立了同时快速测定氯离子、磷酸根离子、柠檬酸根离子、钠离子、钾离子、镁离子含量的等度洗脱离子色谱法，具有操作简便，直接进样，灵敏度高等优点，是目前最常用的阴阳离子分析方法。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

930 Compact IC Flex 离子色谱仪（瑞士万通，配自动淋洗液发生器，CO2抑制器MCS，MagIC Net 3.2 色谱工作站）；阴离子色谱柱：Metrosep A SUPP 5 column（50 mm×4 mm），阴离子保护柱：Metrosep A SUPP 5 Guard/4.0；阳离子色谱柱：Metrosep C4column（250 mm×4 mm），阳离子保护柱：Metrosep C4Guard/4.0；On-GuardH 柱及C18预处理小柱（美国戴安公司）；万分之一天平（Sartorius，BT25S）；十万分之一天平（Sartorius，BT25S）。

1.2 药品与试剂

氯化钾对照品（纯度99.8%，批号：20190414）、六水合氯化镁（纯度99.8%，批号：20180804），均为国药集团化学试剂有限公司；氯化钠对照品（纯度99.8%，批号：20180619）、一水合柠檬酸（纯度99.8%，批号：20180313）、氯化钠（纯度99.8%，批号：20180619），均为南京化学试剂公司；磷酸二氢钠（纯度99.8%，批号：20180804，永华化学科技公司）；口服电解质：商品名Solita-T®granules No.3（批号：4F371、4F373、4F375、4F377、4F379，日本味之素制药）；硝酸（纯度100.0%）、碳酸钠（纯度100.0%）分析纯，市售；超纯水和二次去离子水（用超声波脱气）。

2 方法和结果

2.1 阴离子（氯、磷酸根、柠檬酸根离子）测定

2.1.1 供试品溶液的制备取本品5 包称定，研细，精密称取细粉适量，置50 mL 量瓶中，加水适量超声使电解质颗粒溶解，用水稀释至刻度，摇匀，作为储备液（约每毫升含氯离子1065 μg、磷酸根475 μg、柠檬酸根2160 μg）。取储备液2.0 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.1.2 对照品的制备精密称取一水合柠檬酸、氯化钠、磷酸二氢钠对照品适量，加水适量使溶解并稀释成每毫升约含氯离子1065 μg，磷酸根475 μg和柠檬酸根2160 μg 的混合对照品储备溶液，取该储备液2.0 mL，置50 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

2.1.3 色谱条件与系统适用性试验取一水合柠檬酸、氯化钠、磷酸二氢钠对照品适量，加水适量使溶解并稀释成每毫升约含氯离子42.60 μg、磷酸根19 μg 和柠檬酸根86.4 μg 的溶液作为系统适用性溶液，采用Metrosep A Supp-5 column（150 mm×4 mm）色谱柱；流动相：碳酸钠溶液（12.8 mmol·L-1）、等度洗脱；柱温：30 ℃；流速：0.7 mL·min-1；进样量：20 μL；电导检测器。在上述条件下，各峰之间的分离度良好（Rs＞1.5），出峰顺序依次为氯离子、磷酸根、柠檬酸根。色谱图见图1。

图1 系统适用性色谱图

2.1.4 专属性取处方中不含3 种阴离子的其他成分，稀释成与供试品、对照品相同倍数的空白溶液，与混合对照品、供试品一并分析。结果显示，本方法测定处方中3 种阴离子的专属性良好，不受溶液中其他成分（阳离子、香料、乙基香草醛、香兰素、丙二醇等）的干扰，且空白辅料和溶剂中没有干扰峰，各阴离子之间分离度良好。色谱图见图2。

图2 空白溶液离子（A）、标准溶液阴离子（B）、供试品溶液阴离子（C）色谱图

2.1.5 线性关系考察精密量取对照品储备液1、1.4、2.0、2.6、3 mL 分别置于50 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，得相当于氯离子浓度分别为21.30、29.82、42.60、55.38、63.90 μg·mL-1，磷酸根浓度分别为9.500、13.30、19.00、24.70、28.50 μg·mL-1，柠酸根浓度分别为43.20、60.48、86.40、112.3、129.6 μg·mL-1的系列对照品溶液。按“2.1.3”项下色谱条件进样，以样品浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，拟合回归方程见表1。

表1 阴离子含量测定法的线性范围

2.1.6 检测限和定量限取“2.1.2”项下对照品适量，等倍逐步稀释，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积。当信噪比为10∶1 时，得定量限；当信噪比为3∶1 时，得检测限。结果LOD 和LOQ氯离子分别为2.130 ng·mL-1和6.390 ng·mL-1；磷酸根分别为3.160 ng·mL-1和9.500ng·mL-1；柠檬酸根分别为54ng·mL-1和162 ng·mL-1。

2.1.7 进样精密度试验取“2.1.2”项下对照品溶液20 μL，按“2.1.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果氯离子、磷酸根、柠檬酸根的RSD 分别为0.14%、0.30%、0.52%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验取“2.1.1”项下供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h，分别进样测定，记录色谱图。结果氯离子、磷酸根、柠檬酸的峰面积RSD 分别为0.23%、1.6%、0.37%，表明供试品溶液在室温24h 内稳定。取“2.1.2”项下对照品溶液，以下操作同上。结果氯离子、磷酸根、柠檬酸的峰面积RSD 分别为0.55%、1.8%、0.29%，表明对照品溶液在室温下24 h 内稳定。

2.1.9 重复性试验取“2.1.1”项下供试品6 份，再按“2.1.3”项下色谱条件连续进样，记录色谱图。结果，6 份供试品溶液中氯离子、磷酸根、柠檬酸的平均含量分别为42.11、18.48、84.98 μg·mL-1，它们的RSD分别为1.3%、0.8%、1.6%，表明本方法重现性良好。

2.1.10 加样回收率试验精密称定本品0.04 g，置50 mL 量瓶中，共9 份，精密加入氯离子、磷酸根、柠檬酸根质量浓度分别为1065、475、2160 μg·mL-1的混合对照品溶液7.0、8.0、10.0 mL 各3 份，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，得低、中、高（70%、100%、130%）3 个浓度，注入离子色谱仪进行测定，计算回收率，本方法的准确度良好。见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.2 阳离子（钠离子、钾离子、镁离子）测定

2.2.1 供试品溶液的制备取本品5 包，称定，研细，精密称取细粉适量，置100 mL 量瓶中，加水适量超声振荡使电解质颗粒溶解，用水稀释至刻度，摇匀，作为储备液（约每毫升含钠离子805μg、钾离子780 μg、镁离子36 μg）。取储备液2.0 mL 置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.2.2 对照品的制备精密称取氯化钠、氯化钾、六水合氯化镁对照品，置于100 mL 量瓶，加水适量溶解并稀释成每毫升约含钠离子805 μg、钾离子780 μg 和镁离子36 μg 的混合对照品储备液，取储备液2.0 mL，置50 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，作为混合对照品溶液。

2.2.3 色谱条件与系统适用性试验精密称取氯化钠、氯化钾、六水合氯化镁对照品置于100 mL 量瓶，加水适量使溶解并稀释成每毫升约含钠离子32.20 μg、钾离子31.20 μg 和镁离子1.44 μg 的混合对照品储备液，采用Metrosep A Supp-5 column（250mm×4mm）色谱柱；流动相为硝酸溶液（12.8mmol·L-1），等度洗脱；柱温：30 ℃；流速：0.7 mL·min-1；进样量：20 μL；电导检测器。在上述条件下，各峰之间的分离度良好（Rs＞1.5），出峰顺序依次为钠离子、钾离子、镁离子，且分离度良好。色谱图见图3。

图3 系统适用性色谱图

2.2.4 专属性取处方中不含3 种阳离子的其他成分，稀释成与供试品、对照品相同倍数的空白溶液，与混合对照品、供试品一并分析。结果显示，本方法测定处方中3 种阳离子的专属性良好，不受溶液中其他成分（阴离子、香料、乙基香草醛、香兰素、丙二醇等辅料）的干扰，因此空白溶液中没有干扰峰，各阳离子之间分离度良好。色谱图见图4。

图4 空白溶液离子（A）、标准阳离子溶液（B）、供试品溶液阳离子（C）色谱图

2.2.5 线性关系考察精密量取“2.2.2”项下对照品储备液1、1.4、2.0、2.6、3 mL 分别置于50 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，得相当于钠离子浓度分别为16.07、22.50、32.15、41.79、48.22 μg·mL-1，钾离子浓度分别为15.69、21.97、31.39、40.80、47.08 μg·mL-1，镁离子浓度分别为0.7290、1.021、1.458、1.896、2.187 μg·mL-1的系列对照品溶液。按“2.2.3”项下色谱条件进样，以样品浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，拟合回归方程见表3。

2.2.6 检测限和定量限取“2.2.2”项下对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.2.3”项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。当信噪比为10∶1 时，得定量限；当信噪比为3∶1 时，得检测限。结果LOD 和LOQ 钠离子分别为0.0321μg·mL-1和0.107μg·mL-1；钾离子分别为0.03138 μg·mL-1和9.500 μg·mL-1；镁离子分别为0.001458 μg·mL-1和0.00486 μg·mL-1。

表3 阳离子含量测定法的线性范围

2.2.7 精密度试验取“2.2.2”项下对照品溶液20μL，按“2.2.3”项下色谱条件连续进样测定，记录色谱图。结果RSD 钠离子为0.56%、钾离子为0.65%、镁离子为0.97%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验取“2.2.1”项下供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h，分别进样测定，记录色谱图。结果钠离子、钾离子、镁离子的峰面积RSD分别为0.32%、0.31%、1.27%，表明供试品溶液在室温24 h 内稳定；取“2.2.2”项下对照品溶液，以下同上操作。结果钠、钾、镁离子的峰面积RSD 分别为0.39%、0.32%、1.66%，表明对照品在室温24h 内稳定。

2.2.9 重复性试验取“2.2.1”项下供试品6 份，按“2.2.3”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以外标法计算钠、钾、镁离子的含量，其含量的RSD 分别为0.2%、0.25%、0.08%，表明本方法重现性良好。

2.2.10 加样回收率试验精密称定本品0.04 g，置50 mL 量瓶中，共9 份，精密加入钠、钾、镁离子质量浓度分别为805、780、36 μg·mL-1的混合对照品溶液0.4、1.0、1.6 mL，各3 份，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，得低、中、高（70%、100%、130%）3 个浓度，注入离子色谱仪进行测定，计算回收率，本方法的准确度良好。见表4。

表4 加样回收率试验结果

2.3 样品测定

对5 批样品照上述方法测定,按外标法计算各离子的含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果（μg·mL-1）

3 讨论

3.1 淋洗液条件的选择

分离效果一方面取决于待测离子的浓度，另一方面取决于淋洗液的浓度，即淋洗液的浓度影响着分离时间和分离度。对于阴离子分析，本实验比较了7 mmol·L-1Na2CO3+3 mmol·L-1NaHCO3+5%丙酮（图5A）、7 mmol·L-1Na2CO3+3 mmol·L-1NaHCO3+25%丙酮（图5B）及不用丙酮，改为12.8 mmol·L-1Na2CO33 种淋洗液对分离效果的影响。

图5 不同淋洗条件下的色谱图

图5A 与图6B 相比，随着丙酮浓度增加，柠檬酸保留时间缩短，峰形变得尖锐。但因加入高浓度的丙酮后，基线漂移严重，且随着进样次数增加，保留时间越来越延后，还会出现抑制器饱和的现象，故不加入丙酮，逐渐改变Na2CO3的浓度，最后确定12.8 mmol·L-1Na2CO3作为淋洗液进行阴离子分子最为合适，经济适用且环保。

在使用离子色谱测定阳离子时，大部分文献所采用的的流动相是20 mmol·L-1甲基磺酸，本实验采用5 mmol·L-1硝酸便可使各个离子得到很好的分离。实验过程中考察了1、5、10、15 mmol·L-1硝酸对钠、钾、镁的分离效果。结果显示，5 mmol·L-1硝酸即可实现钠钾镁的有效分离，且分离度＞1.5。见表6。

表6 标准淋洗液流速下各阳离子色谱峰分离度

3.2 抑制器转换

过高浓度的淋洗液会使抑制器容量饱和，实验使用了在采集时间内对抑制器进行命令，使其8 分钟切换一次，避免抑制器饱和致使基线抬高，背景增大，且切换时间在磷酸根与柠檬酸根出峰时间之间，避免了对离子出峰的干扰。

3.3 柠檬酸根离子与等度洗脱

柠檬酸是弱有机酸，在离子色谱柱上保留较强，常用梯度洗脱方式与其他常见阴离子进行分离，但分析时间较长，对设备配置要求高。本实验采用简单的等度洗脱进行柠檬酸根测定，其离子能快速出峰，且峰型平稳，有效避免了梯度洗脱使基线不平稳，对仪器的配置要求高（通常需要配置四元泵或者二元泵）的麻烦。