UPLC-MS 法测定艾滋合并结核患者血浆中替诺福韦浓度*

邢亚茹，张丽军，乐晓琴，陈 军，尹 林，卢洪洲，李迎迎

1 桂林医学院，桂林 541004；2 上海市公共卫生临床中心，复旦大学，上海 201508

目前，艾滋病（AIDS）仍然是全球主要公共卫生问题。艾滋病患者合并感染结核（TB）的风险比未感染HIV 者高26 倍[1]。富马酸替诺福韦酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）为替诺福韦（tenofovir，TFV）的口服前体药物，是目前治疗艾滋病的一线药物，但是TFV 与肾脏损伤、特别是近端小管病变有关[2]。因此，对于艾滋合并结核的患者，测定TFV 的浓度可以协助临床优化个体用药，降低药物毒副作用，还能为抗艾滋药物-抗结核药物相互作用的研究提供基础数据。

目前文献[3-5]报道的关于测定人血浆中TFV 浓度的方法主要有高效液相色谱法（HPLC），紫外二极管阵列高效液相色谱法（UV-DAD-HPLC），高效液相-荧光法和高效液相色谱串联质谱法（LC-MS）等。但是在一些方法中，样品制备操作较繁琐，且费用较高[4，5]。本文建立了一种UPLC-MS 法测定人血浆中TFV 的浓度，该方法简单、快速，且已成功用于艾滋合并结核患者血浆中TFV 浓度的检测。

1 仪器与药品、试剂

超高效液相色谱仪（UPLC，美国Waters 公司）；质谱分析仪（SCIEX 5500 QTRAP，美国AB 公司）；百万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo XPE26，Mettler Toledo 公司）。

TFV 对照品（纯度99.7%）、内标TFV-d7（纯度99.6%）为TLC pharmaceutical standards 公司产品；甲醇为色谱纯；甲酸铵为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱、质谱条件

2.1.1 色谱条件色谱柱：Kinetex Phenyl-Hexyl（50 mm×3.0 mm，2.6 μm）；流动相：5 mmol·L-1甲酸铵溶液（A）-甲醇溶液（B）；柱温：40 ℃，每个样品分析时间为3.5 min；进样量：10 μL。流速为：0.0～0.5 min，0.2 mL·min-1；1.0～2.0 min，0.4 mL·min-1；2.5～3.5 min，0.35 mL·min-1。

2.1.2 质谱条件离子源：ESI（电喷雾电离源）；正离子模式扫描；喷雾电压：5.0 kV；脱溶剂气温度：550 ℃；雾化气：414 kPa；辅助加热气：414 kPa；气帘气：138 kPa；碰撞气：中等流速（200～600 μL·min-1）。

扫描方式：多反应监测模式（MRM），TFV 和TFV-d7 的质谱检测参数见表1。

表1 TFV、TFV-d7 检测的质谱参数

在选定的质谱条件下，TFV 和TFV-d7 的离子对分别是288.0→176.1、295.3→183.2。见图1。

图1 TFV（A）和TFV-d7（B）的质谱图

2.2 溶液的配制

精密称取TFV 对照品2.992 mg，置于4 mL 安瓿瓶中，用10%甲醇溶解，得到1 mg·mL-1的储备液。然后用50%甲醇（1∶1，v∶v）稀释得到质量浓度为2000、1000、400、160、50、20、10 ng·mL-1的系列对照品溶液和1600、800、160、30、10 ng·mL-1的系列质控溶液。然后用空白血浆将对照品溶液和质控溶液稀释10 倍，得到对照品血浆样品溶液和质控血浆样品溶液。TFV-d7 标准品同样溶于10%甲醇中，得到浓度为1 mg·mL-1的内标溶液。

2.3 血浆样品预处理

取血浆样品50 μL 至1.5 mL 离心管中，加入甲醇150 μL（含TFV-d7 50 ng·mL-1），混匀，4 ℃、12000 r·min-1离心10 min，取上清液50 μL 置入EP管中，用100 μL 超纯水稀释，混匀后取100 μL 加入进样瓶内，进样10 μL。

2.4 选择性

按照“2.3”项下方法处理6 份不同来源的空白血浆，且不加内标。观察内源性物质是否干扰TFV和TFV-d7 的检测。

进样标准血浆对照品（定量下限，LLOQ）和临床样品，均在1.5min 附近检测到了单一的TFV 和TFVd7 色谱峰，而空白血浆在1.5 min 时无色谱峰，因此空白血浆不影响TFV 和TFV-d7 的检测。见图2。

图2 分析物及其内标的色谱图

2.5 标准曲线制备

取“2.2”项下系列标准血浆样品，按照“2.3”项下方法预处理后进样分析，以TFV 与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标、TFV 浓度（X）为横坐标，用加权最小二乘法（权重因子1/χ2）线性回归得到标准曲线（Y=3.65×10-2X-2.03×10-3，r=0.9983），线性范围为1～200 ng·mL-1，LLOQ 为1 ng·mL-1。

2.6 精密度和准确度试验

取空白血浆，将质控溶液稀释10 倍，配制浓度为160、80、16、3、1 ng·mL-1的质控品各6 份，按照“2.3”项下方法预处理后进样分析。连续测定3 个分析批。日内准确度在93.65%～103.45%，精密度（RSD）在2.42%～9.50%；日间准确度在96.42%～102.35%，精密度（RSD）在4.93%～12.54%。

2.7 提取回收率试验

配制低、高浓度的血浆质控样品各6 份，按照“2.3”项下方法预处理后进行分析，记录TFV 峰面积（A1）和内标峰面积。另取50μL 空白血浆，按照“2.3”项下方法预处理，加入等量质控溶液和内标溶液，进样分析，记录TFV 峰面积（A2）和内标峰面积。用A1与内标峰面积比值的平均值同A2与内标峰面积比值的平均值进行比值计算，得TFV 低、高质控样品提取回收率平均值，分别为114.36%、112.96%。RSD 均＜15%。

2.8 基质效应

用超纯水将质控溶液稀释10 倍，配制低、高2 个浓度的质控品各6 份，按照“2.3”项下方法处理后进样分析，记录TFV 峰面积（A3）和内标峰面积。用A2与内标峰面积比值的平均值同A3与内标峰面积比值的平均值进行比值计算，得TFV 低、高质控样品基质效应平均值分别为89.49%、89.60%，RSD 均＜15%。

2.9 稀释质控样品考察

配制血浆浓度为400 ng·mL-1的质控样品，加入4 倍（稀释因子=5）或者3 倍（稀释因子=4）体积的空白血浆，稀释制备成80、100ng·mL-1的2 种质控样品，按照“2.3”项下方法处理后进样分析，测得上述质控样品和血浆样品被不同比例稀释后的精密度，分别为5.81%和13.09%，准确度分别为89.39%和100.9%。

2.10 稳定性试验

配制低、高2 个浓度的质控样品各6 份，进行表2 内5 种条件的实验。按照“2.3”项下方法预处理进样分析，与新配制的标准曲线同时分析。稳定性试验表明，TFV 在不同条件下的稳定性良好，准确度在85%～115%，精密度＜15%。

表2 不同储存条件下血浆中TFV 的稳定性（n=6）

2.11 UPLC-MS 法的应用

本研究建立的UPLC-MS 法成功用于艾滋合并结核患者血浆中TFV 浓度的测定。入组21 例艾滋合并结核患者（男性19 例），平均年龄46.56 岁（22～72 岁）。19 例用药方案为TDF+3TC+DTG，2 例用药方案为ETV/TDF+DTG。结核用药有：利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、异烟肼、阿米卡星、左氧氟沙星、莫西沙星等。每例采集了不同时间点的2 份样本，谷浓度和给药后（3±1）h 各1 分。每次采集2 mL 血液至K2EDTA 抗凝管，离心后吸取50 μL 血浆用于TFV 血药浓度检测。该项目经上海公共卫生临床中心伦理委员会批准（批件号：2017-Y037），所有患者均签署了知情同意书。TFV 血药浓度平均为108.54±87.94（2.02～413）ng·mL-1，谷浓度平均为82.26±58.29（2.02～276）ng·mL-1。其中6 份样品超出了定量上限（200 ng·mL-1），采用稀释后复测的结果。患者临床信息与药物浓度情况见表3。

3 讨论

3.1 方法的选择

建立的UPLC-MS 法测定人血浆中TFV 浓度，样品采用甲醇沉淀蛋白质法，方法简单易操作，样品用量少。TFV 浓度测定采用正离子多反应监测（MRM）模式，信号强度高，峰形良好，提取回收率、精密度和准确度均满足《中国药典》（2015 版）的要求。

表3 艾滋合并结核患者的临床信息及药物浓度

3.2 方法的应用

本方法测得21 例艾滋合并结核患者的TFV 血药浓度平均为（108.54±87.94）ng·mL-1。这与以往研究结果基本一致[3，6，7]，例如，Rungtivasuwan K 等[3]对150 名泰国艾滋病患者的TFV 血药浓度进行测定，平均浓度为（100.3±52.7）ng·mL-1；Manosuthi W 等[6]测定了117 例以替诺福韦/拉米夫定/依非韦伦治疗的HIV-1 感染患者TFV 血药浓度，其24 周后血浆TFV 平均浓度为（105±46）ng·mL-1。可能为所选人群的差异。Wiriyakosol N 等[8]测得80 例感染HIV-1泰国患者的平均血浆TFV 浓度为（78.1±46.6）ng·mL-1（12.5～229.4 ng·mL-1），中值为62.4 ng·mL-1。本研究的艾滋合并结核患者与文献报道的单纯艾滋感染人群的TFV 浓度基本一致[3，6，7]，未发现结核药物对TFV 的明显影响。