控制性超排卵对围着床期小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3 和LIF表达的影响

张 磊，刘 杰，张 英，王 芳，李长雷，付艾妮，游 俊，朱书秀

（1.江汉大学医学院，湖北 武汉430056；2.湖北省妇幼保健院生殖医学中心，湖北 武汉430070）

辅助生殖技术为治疗不孕不育症提供了有效治疗方案。控制性超排卵（controlled superovulation，COH）通过药物介入在可控制的范围内诱发多个卵泡发育成熟，从而保证胚胎移植顺利进行，但仍存在胚胎着床率及妊娠率低下等棘手问题［1］。胚胎植入失败是影响体外受精-胚胎移植妊娠率的主要因素，子宫内膜仅在特定而短暂的时间窗口期（即种植窗期）允许胚胎植入，使其完成定位、黏附、植入过程。围着床期子宫内膜处的HOXA10、整合素αvβ3 和LIF 表达增强［2，3］。研究发现将HOXA10基因正常的小鼠胚胎移植到敲除HOXA10 基因的小鼠子宫内则胚胎不能着床［4］。也有研究表明［5］COH 所用药物可使体内激素水平超常，影响子宫内膜环境，导致胚泡着床率低下。因此，本研究旨在通过观察围着床期子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3和LIF 的表达，探讨COH 药物对子宫内膜容受性的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

240 只性成熟昆明小鼠由武汉春玉红实验动物饲料有限公司提供［动物许可证号码：SCXK（鄂）2017-0012］，鼠龄8 周，体质量30～35 g。其中雌性小鼠160 只，雄性小鼠80 只（结扎、交配用）。正常摄食和饮水，光照和黑暗各12 h，室温18～22 ℃，相对湿度为60%～80%。

雌鼠随机分为自然周期鼠、COH 鼠（经COH 造模），各80 只；两组再均分为供体鼠（提供囊胎移植用）和假孕鼠（接受移植囊胎）。经囊胚移植后分为4 组，即：自然囊胚+自然假孕组（将自然周期供体鼠囊胚移植于自然周期假孕鼠）、COH 囊胚+自然假孕组（将COH 供体鼠囊胚移植于自然周期假孕鼠）、自然囊胚+COH 假孕组（将自然周期供体鼠囊胚移植于COH 假孕鼠）、COH 囊胚+COH 假孕组（将COH 供体鼠囊胚移植于COH 假孕鼠），每组20 只。

1.2 主要试剂与仪器

孕马血清促性腺激素（宁波三生药业有限公司），曲普瑞林（法国益普生生物制药有限公司），人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG，丽珠集团丽珠制药厂），Trizol（美国Invitrogen 公司），cDNA 第一链合成试剂盒（立陶宛Fermentas 公司），HOXA10 抗体（美国GeneTex 公司），整合素αvβ3 抗体（美国Abcam 公司），LIF 抗体（中国台湾Origo 公司），Western-blot 主要试剂购自碧云天公司。

倒置显微镜（日本奥林巴斯，CKX31），二氧化碳培养箱（美国Therm 公司，3111 型），体视显微镜（日本尼康，SMZ800N），荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司，QuantStudio 6），水平电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司，JY300）。

1.3 模型制备

COH 模型制备［6］：采用控制性超促排长方案，每天上午8 时腹腔内注射曲普瑞林（0.4 μg/100 g），连续9 d 进行降调节；第9 天上午8 时同时注射孕马血清促性腺激素（40 U/100 g）1 次，进行Gn 启动；48 h 后注射HCG（100 U/100 g）。

雄性结扎鼠制备：10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，轻压腹腔，将小鼠两侧睾丸压回阴囊，切开阴囊处皮肤及中间间隔左右的包膜，分离暴露出双侧输精管，用烧红的镊子将其烧烙掉，缝合包膜及皮肤。术后1 周与发情期的雌鼠1∶1 合笼7 d，观察雌鼠无妊娠即表明结扎成功。

1.4 处理方法［6］

1.4.1 囊胚获取 注射HCG 后供体鼠与未结扎雄鼠按雌∶雄=l∶1 合笼，次日上午8 时检查雌鼠是否存在阴栓，见阴栓者记为孕第1 天。于孕第4 天下午14 时，采取颈椎脱臼法处死小鼠，取出子宫，获取囊胚，转移至装有M16 培养基的培养皿中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中准备种植。

1.4.2 假孕鼠的准备 与供体鼠同时进行，性成熟未孕雌鼠与雄性结扎鼠1∶l 合笼，次日上午8 时检查雌鼠是否存在阴栓，见阴栓者记为假孕小鼠，并标记好见栓日期。

1.4.3 囊胚移植 将孕第4 天供体鼠的囊胚移植至同日见阴栓的假孕鼠子宫内。具体移植方法如下：10%水合氯醛腹腔注射受体鼠，待麻醉后剃除背部被毛、消毒，于背部正中左右两旁开1 cm 处切开皮肤，分离肌肉等组织，钝头镊子夹出子宫，将小鼠置于立体显微镜下，距子宫角5 mm 处进行植入，左右均移植8 个囊胚，术后置于50 W 灯泡下保暖，直至苏醒。

1.5 Western blot 检测子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF 蛋白表达

取妊娠第5 天（移植后24 h）的小鼠子宫，纵行剖开，剥离内膜，剔除囊胚，电动匀浆器匀浆，采用细胞裂解液提取总蛋白，经SDS-PAGE 电泳分离蛋白，湿转法将目的蛋白转到PVDF 膜上，一抗、二抗依次孵育。暗室环境中运用ECL 化学发光法进行曝光显色，运用Image-J 图像分析软件进行分析，采用目的蛋白/内参蛋白的比值比较各组蛋白表达。

1.6 RT-PCR 检测子宫内膜、整合素αvβ3 和LIF mRNA 的表达

将妊娠第5 天（移植后24 h）的小鼠子宫内膜剥离，运用Trizol 提取组织内的RNA，将得到的RNA样本进行逆转录，获得cDNA 后置于−20 ℃保存。以GAPDH 为内参，实时定量PCR 扩增反应检测、整合素αvβ3 和LIF mRNA 表达量变化，引物序列见表1。反应条件：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，25 s，30 个循环；72 ℃，4 min，4 ℃，4 min。基因相对表达量采用2-△△CT的方法进行分析。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.7 胚胎着床的观察与计数

妊娠第6 天（移植后48 h），将0.3 mL 0.5%台盼蓝注入小鼠尾静脉，5 min 后颈椎脱臼法处死小鼠，剖腹暴露双侧子宫，看到被蓝染的小鼠胚胎即为着床位点，计算各组妊娠小鼠数及胚胎着床位点数。妊娠率（%）=妊娠鼠数/总动物数×100%，平均胚胎着床位点数=总胚胎着床位点数/妊娠鼠数［6］。

1.8 统计学处理

采用SPSS23.0 软件进行数据分析。计数资料以频数表示，采用χ2分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步通过Tukey 和SNK 检测的方法分析两组之间的差异，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠妊娠率及着床位点数

经胚胎移植后，自然囊胚+自然假孕组的妊娠率较自然囊胚+COH 假孕组和COH 囊胚+COH假孕组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；COH 囊胚+自然假孕组的妊娠率较自然囊胚+COH 假孕组和COH 囊胚+COH 假孕组高，但是各组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）；自然囊胚+自然假孕组的胚胎着床位点数显著高于自然囊胚+COH 假孕组，COH 囊胚+自然假孕组胚胎着床数高于COH 囊胚+COH 假孕组，差异有统计学意义（P＜0.05）；但自然囊胚+自然假孕组与COH 囊胚+自然假孕组之间差异无统计学意义（P＞0.05），同时自然囊胚+COH 假孕组与COH 囊胚+COH 假孕组之间差异也无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠妊娠率及胚胎着床位点数Tab 2 Pregnancy rate and embryo implantation sites in each group

2.2 小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF 蛋白表达

自然囊胚+自然假孕组和COH 囊胚+自然假孕组的HOXA10、整合素αvβ3 和LIF 蛋白表达均高于自然囊胚+COH 假孕组与COH 囊胚+COH 假孕组，差异有统计学意义（P＜0.01）；自然囊胚+自然假孕组与COH 囊胚+自然假孕组相比，相关蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05）；同样，自然囊胚+COH 假孕组与COH 囊胚+COH 假孕组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表3。

2.3 小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3 和LIF mRNA 的表达

自然囊胚+自然假孕组和COH 囊胚+自然假孕组的HOXA10、整合素αvβ3 和LIF mRNA 表达均高于自然囊胚+COH 假孕组与COH 囊胚+COH 假孕组，差异有统计学意义（P＜0.01）；自然囊胚+自然假孕组与COH 囊胚+自然假孕组、自然囊胚+COH 假孕组与COH 囊胚+COH 假孕组之间，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

图1 各组小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF 蛋白表达Fig 1 Expression of HOXA10，integrin αvβ3，and LIF protein in the endometrium of of mice in each group

表3 各组小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF蛋白表达（n=5，±s）Tab 3 Expression of HOXA10，integrin αvβ3 and LIF protein in the endometrium of mice in each group（n=5，±s）

表3 各组小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF蛋白表达（n=5，±s）Tab 3 Expression of HOXA10，integrin αvβ3 and LIF protein in the endometrium of mice in each group（n=5，±s）

注：与自然囊胚+COH 假孕组相比，*P＜0.01；与COH 囊胚+COH假孕组相比，#P＜0.01。

组别自然囊胚+自然假孕组自然囊胚+COH假孕组COH囊胚+COH假孕组COH囊胚+自然假孕组FP HOXA10 0.66±0.12*#0.28±0.04 0.24±0.07 0.70±0.08*#26.488 0.000整合素αvβ3 0.50±0.07*#0.20±0.03 0.15±0.01 0.51±0.09*#29.350 0.000 LIF 0.73±0.08*#0.40±0.04 0.32±0.04 0.69±0.03*#47.903 0.000

表4 各组小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF mRNA 表达（n=5，±s）Tab 4 Expression of HOXA10，integrin αvβ3 and LIF mRNA in the endometrium of each group of mice（n=5，±s）

表4 各组小鼠子宫内膜HOXA10、整合素αvβ3、LIF mRNA 表达（n=5，±s）Tab 4 Expression of HOXA10，integrin αvβ3 and LIF mRNA in the endometrium of each group of mice（n=5，±s）

注：与自然囊胚+COH 假孕组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与COH 囊胚+COH 假孕组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

LIF 1.147±0.147**##0.517±0.146 0.539±0.073 1.197±0.171**##45.745 0.000组别自然囊胚+自然假孕组自然囊胚+COH 假孕组COH 囊胚+COH 假孕组COH 囊胚+自然假孕组FP HOXA10 1.074±0.222*#0.634±0.125 0.657±0.085 1.164±0.215**##23.946 0.000整合素αvβ3 1.019±0.180*#0.587±0.132 0.585±0.126 1.194±0.199**##29.947 0.000

3 讨论

子宫内膜容受性是指子宫内膜接受胚泡植入的能力，内膜仅在“种植窗期”允许胚泡植入，是体外受精-胚胎移植成功与否的关键因素之一。影响子宫内膜容受性的因素有许多，如雌、孕激素，子宫内膜厚度、类型、血供，局部微环境以及自分泌旁分泌细胞因子等。目前普遍认为整合素αvβ3、LIF 是评估子宫内膜容受性的重要指标［7，8］。而在基因方面，HOXA10 是容受性的重要调节因子。

HOXA10 是同源盒基因家族中的一员，表达于子宫内膜上皮的间质和肌层，与子宫内膜容受性密切相关［9］，对子宫内膜的发育具有时空表达的特异性［10］，能调控月经周期中不同时期的子宫内膜形态。在人类自然周期中，排卵后5～7 d 子宫内膜上皮细胞HOXA10 呈现特异性高表达，与子宫内膜种植窗期同步［3］，从而对胚胎着床进行精细调控。当子宫内膜细胞HOXA10 表达出现缺陷时，可引起容受性下降，造成胚胎植入失败［11］。近期研究显示，与正常生育妇女相比，子宫内膜异位症患者的子宫内膜HOXA10 表达明显下降［12］。也有研究发现，HOXA10 的表达受LIF、雌孕激素等因素的调节，可通过抑制EMX2 基因来上调整合素avβ3 在子宫内膜细胞中的表达，参与胚胎着床与发育［10］。

整合素avβ3 是细胞黏附分子家族的重要成员，主要介导细胞之间的黏附及信号转导，以及促进胚泡植入和胎盘滋养层的形成等［13］，是公认的与子宫内膜容受性相关的黏附分子，可反映子宫内膜容受性［14］。LIF 是白细胞介素-6 家族中的细胞因子之一，参与了胚泡着床。研究发现，不明原因不孕患者子宫内膜整合素avβ3、LIF 表达降低［15，16］。

本研究发现，COH 假孕鼠接受胚泡移植后，种植窗期子宫内膜HOXA10、αvβ3 和LIF 的表达均低于自然周期鼠。其他学者也发现，促性腺激素释放激素（GnRH）治疗后，小鼠子宫内膜LIF 蛋白表达减少［17］；子宫内膜HOXA10 蛋白及mRNA 表达在种植窗期也出现减少［18］。研究中还观察到COH 假孕鼠接受囊胚移植后，临床妊娠率和胚胎着床位点数均低于接受囊胚移植的自然假孕鼠，说明IVFET 妊娠率低可能与子宫内膜容受性受损有关。

GnRH 是由下丘脑神经元合成并作用于垂体的十肽化合物［19，20］，呈脉冲式分泌，通过下丘脑-垂体-卵巢轴对生殖活动发挥作用。在COH 过程中，GnRH 释放激素类似物（GnRHa）活性远强于天然GnRH，在超生理剂量的GnRHa 长时间作用下，垂体GnRH 释放被阻断，卵巢功能受限，影响到体内激素合成及黄体功能，导致子宫内膜发育不良［21］。同时，子宫内膜的发育主要受雌孕激素的调控，在生理状态下，雌激素水平低下可延长种植窗期时相，而高水平则促使其提前关闭，并改变相关基因表达［22］。在体外受精-胚胎移植过程中，体内雌孕激素显著性增加［23］，雌激素和孕激素可调节子宫内膜HOXA10 基因的表达，且呈剂量依赖性［24］。由此可认为，超排卵药物可导致体内雌孕激素水平升高，诱导子宫内膜容受性标志物HOXA10、整合素αvβ 3、LIF 等高表达时相前移，引起种植窗期表达减少，受精卵发育与子宫内膜不同步，种植窗期提前，从而导致临床妊娠率低。