基于网络药理学探讨黄芪-紫草药对治疗糖尿病溃疡的作用机制

樊炜静，李远翔，卢慧敏，徐 烽，柳国斌

（上海中医药大学附属曙光医院，上海200032）

糖尿病溃疡作为糖尿病较为常见的并发症，是糖尿病患者致死致残的主要原因之一。据统计，全球有超过3.5 亿人患有2 型糖尿病，其中有大约20%的人会在有生之年发展为糖尿病溃疡［1］。尽管越来越多的治疗方法被发现和使用，但仍有近40%的患者的溃疡不能在1 年内愈合，有数据显示超过10%的糖尿病溃疡患者最终会面临截肢［2，3］。因此，如何解决糖尿病溃疡延期愈合的问题，已经成为一个世界性的难题。

近年来，中医药作为一种安全且有效的治疗方法，在糖尿病溃疡的治疗中得到了越来越多人的认可。黄芪为豆科植物蒙古黄芪和膜荚黄芪的干燥根，味甘，性温，归肺、脾经，有益气升阳固表、托毒生肌排脓的作用；紫草为紫草科植物新疆紫草、紫草或内蒙紫草的干燥根，味甘、咸、寒，归心、肝经，有凉血活血，解毒透毒的功效［4］。现代研究证明黄芪中皂甙、蔗糖、多糖、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素有增强机体免疫功能、抗应激和较广泛的抗菌作用［5，6］；紫草素对大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用，其乙醚、水、乙醇提取物也有一定的抗炎作用［7］。

黄芪与紫草配伍，二者一温一寒，攻补兼施，既能凉血活血，又能补足正气，既能迫毒外出，又能及时生肌收口，对于糖尿病溃疡这一类以正虚邪盛为主要病机特点的慢性消耗性疾病有较好治疗效果。上海中医药大学附属曙光医院将黄芪与紫草配伍，结合朱砂、冰片、阿胶、龙血竭，制成外用制剂紫朱软膏，并使用紫朱软膏治疗糖尿病溃疡，已经证实有确切疗效［8-10］。为深入研究黄芪-紫草药治疗糖尿病溃疡的作用机制，本研究使用网络药理学的方法对黄芪-紫草药对的活性成分进行筛选，对其作用靶点进行预测，并通过GO 和KEGG 富集分析对有效成分在疾病效应靶点中的可能作用机制进行预测，以期为未来的实验研究提供更多思路。

1 材料与方法

1.1 黄芪-紫草药对的主要活性化合物的筛选及作用靶点的确定

使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［11］检索黄芪和紫草的活性成分。检索限定条件［12，13］：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%；药物类药性（drug likeness，DL）≥0.18。并通过TCMSP 系统查找黄芪与紫草主要活性化合物的作用靶点，使用Perl 软件（V5.26.3）在Uniprot 数据库［14］（https：//uniprot.org/）中为活性化合物对应关键靶点添加基因号及进行标准化命名。

1.2 糖尿病溃疡疾病靶点的收集

使用人类孟德尔遗传研究平台OMIM（https：//www.omim.org/）和人类基因信息数据库GeneCards（https：//www.genecards.org/），以“diabetic ulcer”为关键词对糖尿病溃疡的疾病相关靶标进行检索。

1.3 药物与疾病共同靶点筛选及互作网络构建

使用R 软件（V3.6.3）筛选黄芪-紫草药对与糖尿病溃疡的疾病相关靶标的交集，绘制Venn 图，得到药物与疾病共同靶点；将共同靶点输入STRING平台［15］（https：//string-db.org/），种属限定为Homosapiens，获取蛋白相互作用关系，构建蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）。

1.4 药物-化合物-作用靶点-疾病作用网络图搭建

使用Cytoscape 3.7.2 软件（http：//www.cytoscape.org/），将黄芪-紫草药对中药物、成分、靶点、通路之间的相互关系构建可视化互作网络图。网络图中“Node”代表药物、活性成分、靶点和疾病，“Edge”代表各个节点之间的联系。

1.5 GO 分析和KEGG 通路富集分析

使用Bioconductor 生物信息软件包（http：//www.bioconductor.org/）对核心靶点基因进行GO基因生物过程富集（gene ontology）［16］和KEGG 信号通路富集（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）［17］分析，其结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 黄芪-紫草药对的主要活性化合物及作用靶点

通过筛选，共32 个主要活性成分被纳入本次研究（表1）；通过TCMSP 检索到黄芪-紫草药对的作用靶点共1 394 个。使用Uniprot 数据库筛选32 个主要活性成分的作用靶点的基因名并进行标准化，删除无效和重复靶点后，最终获取作用靶点98 个。

表1 主要成分及其参数Tab 1 Main constituents and their parameters

2.2 糖尿病溃疡的疾病靶点

通过OMIM 获取糖尿病溃疡疾病靶点169 个，通过GeneCards 获取糖尿病溃疡疾病靶点4 491 个，整理后共收集到糖尿病溃疡疾病靶点共4 585 个。

2.3 黄芪-紫草药对治疗糖尿病溃疡共同靶点筛选及互作网络构建

共得到药物与疾病共同作用靶点81 个（表2）；绘制Veen 图（图1）。通过PPI 网络分析，共得到77个节点和721 条边（图2）。对蛋白互作频次最高的30 个节点进行统计并绘制图形（图3），可以发现白细胞介素-6（IL-6）、胱天蛋白酶3（CASP3）、血管内皮生长因子（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）和丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）等关联程度较高，说明黄芪-紫草药对的中药成分与其有较高的结合活性，可作为其治疗糖尿病溃疡的潜在靶点。

图1 韦恩图Fig 1 Venn diagram

表2 共同作用靶点Tab 2 Common targets

图2 PPI 网络Fig 2 PPI network

2.4 药物-化合物-作用靶点-疾病网络

图3 蛋白频次条形图Fig 3 Bar graph of target protein frequency

使用cytoscape 构建调控网络，共110 个节点（疾病1 个，药物2 个，核心活性成分26 个，靶点81 个）和319 条线。结果显示，槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、谷甾醇（sitosterol）、常春藤皂甙元（hederagenin）等化合物在整个调控网络中发挥着重要的作用，见图4。

2.5 GO 基因生物过程富集分析和KEGG 信号通路富集分析

GO 富集分析共得到100 条生物过程，选择P 值最小的20 条生物过程绘制柱状图（图5a），其中核受体活性（nuclear receptor activity）、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA 结合（transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）、类固醇激素受体活性（steroid hormone receptor activity）、DNA 结合转录激活剂活性，RNA 聚合酶Ⅱ特异性（DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific）、泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding）等生物过程中靶点较为集中。

KEGG 富集分析共得到116 条信号通路，选择P 值最小的20 条信号通路绘制气泡图（图5b），靶基因主要集中在Prostate cancer、Kaposi sarcoma - associated herpesvirus infection、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications 等信号通路。见图6。

图4 药物-化合物-作用靶点-疾病网络图Fig 4 Drug-ingredient-target-disease network

图5 GO 功能（a）与KEGG 通路（b）分析Fig 5 Analysis of GO function（a）and KEGG pathway（b）

图6 KEGG 通路分析图（AGE-RAGE 通路）Fig 6 KEGG pathway analysis（AGE-RAGE signaling pathway）

3 讨论

本次研究通过网络药理学的方法构建了药物-活性成分-靶点-疾病网络，对黄芪-紫草药对治疗糖尿病溃疡的作用机制进行预测，共得到32 个主要活性成分，81 个共同作用靶点，100条生物过程和116 条信号通路。

在筛选出的黄芪-紫草药对的32 个活性成分中，槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、刺芒柄花素（formononetin）、谷甾醇（sitosterol）、常春藤皂甙元（hederagenin）等化合物在药物调控网络中起着重要的作用，提示黄芪-紫草药对可能通过这些有效活性成分对糖尿病溃疡起治疗作用，而既往的药理学研究也在一定程度上对结果进行了验证。槲皮素能够提高巨噬细胞的吞噬功能、影响细胞因子和炎症介质的分泌，从而起到抗炎的作用［18］。山柰酚能够极大抑制肥大细胞炎症反应，通过抑制IKKβ 的活化和IκBα 的磷酸化阻止NF-κB（p65）进入细胞核内，进而影响相关炎症介质的释放；山柰酚也可以通过上调骨骼肌PI3KAKT-GLUT4 信号通路改善胰岛素抵抗，起到降低血糖的作用［19-21］。异鼠李素可以通过激活Nrf2/ARE 信号通路、影响线粒体凋亡通路起到抗氧化、抗凋亡功能［22］。刺芒柄花素可以通过促进淋巴细胞增殖和细胞因子的释放来增强体液免疫和细胞免疫功能，也可以调节体内的血脂代谢，抑制脂肪沉积，对血管病变起到预防和治疗的作用［23，24］。谷甾醇和常春藤皂甙元也有明显的抗菌抗炎作用，对金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，谷甾醇同时有较好的抗氧化作用［25，26］。未来的研究不仅可以聚焦在以上活性成分，对于网络中其他的化合物如毛蕊异黄酮（calycosin）、华良姜素（Jaranol）等同样是药物的潜在作用成分，值得进一步挖掘其药理学作用。

在筛选出的黄芪-紫草药对的81 个共同作用靶点中，作用较多的关键靶点有白细胞介素-6（IL-6）、胱天蛋白酶3（CASP3）、血管内皮生长因子（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、雌激素受体1（ESR1）、细胞周期蛋白D1（CCND1）、ERBB2 等，主要以细胞因子、蛋白激酶等为主。靶点的作用主要集中在抑制炎症反应、抗细胞凋亡、促进细胞增殖、血管生成、免疫调节等，推测其可能是黄芪-紫草药对发挥治疗作用的主要途径。白细胞介素-6（IL-6）是炎症反应的主要介质之一，同时也与内分泌关系密切，主要由单核-巨噬细胞、T 淋巴细胞和纤维母细胞合成，既往研究已经证明其与糖尿病并发症之间的密切关系［27］。血管内皮生长因子（VEGFA）是PDGF/VEGF 生长因子家族的成员，在血管生成、血管发生和内皮细胞生长中都发挥着重要的作用，可以通过ERK、PI3K/Akt 通路诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制凋亡等［28，29］。团队前期的研究表明糖尿病溃疡患者伴随着血管内皮生长因子的明显降低，而黄芪-紫草药对则可以通过增加血管内皮生长因子的表达促进糖尿病溃疡的愈合。胱天蛋白酶3（CASP3）是细胞凋亡过程中最重要的终末裂解酶，也是重要的凋亡相关基因，同时参与炎症信号通路［30］。表皮生长因子受体（EGFR）、ERBB2 均是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一，对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用［31］。丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）又称JNK1/SAPK1基因，功能涉及细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等，不仅可以诱导线粒体释放细胞色素C 而启动死亡信号途径和细胞凋亡，也可以参与TNFα 抑制脂肪细胞分化［32］。

通过GO 富集和KEGG 富集筛选出的黄芪-紫草药对的100 条生物过程和116 条信号通路中，生物过程主要以核受体）、转录因子活性，直接配体调节的序列特异性DNA 结合、类固醇激素受体活性、DNA 结合转录激活剂活性，RNA 聚合酶Ⅱ特异性、泛素样蛋白连接酶结合等为主。在靶点富集的前几条通路中，基因数目主要集中在Prostate cancer、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Fluid shear stress and atherosclerosis、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、TNF signaling pathway 等信号通路。晚期糖基化终产物（AGEs）/晚期糖基化终产物受体（RAGE）信号通路在参与氧化应激和过度炎症反应中起着重要作用，可以激活NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPK 等多种信号，促进多种动脉粥样硬化相关基因（RAGE、VCAM-1、VEGF）的表达。RAGE 与AGEs 结合后RAGE 活化，NF-κB mRNA 基因上调，NF-κBp65 有较强的促炎特性，可以导致IL-1、IL-6 和TNF-α 等多种炎症介质的释放［33］。既往研究已经证明AGEs-RAGE 信号通路在多种糖尿病并发症中的重要作用，黄芪桂枝五物汤通过阻断AGEs/RAGE/NF-κB 信号通路中组织细胞表面RAGE 的表达延缓糖尿病周围神经病变进程；以黄芪为主药的各类中药复方可以通过调节AGEs-RAGE 介导的氧化应激过程、降低AGEs 及RAGE的表达水平以起到防治糖尿病肾病的作用［34-37］。

本次研究通过网络药理学的方法对黄芪-紫草药对治疗糖尿病溃疡的作用机制进行了预测，初步阐释了其潜在的作用成分、作用靶点、关键生物学过程和关键通路，为未来进一步的研究提供参考。