化学竹浆废水活性污泥细菌菌群结构分析

张安龙 王哲毅 王雪青， 罗 清 张仕南

（1.陕西科技大学环境科学与工程学院，陕西西安，710021；2.陕西科技大学轻工科学与工程学院，轻化工程国家级实验教学示范中心，陕西西安，710021；3.西安隆华环保技术有限公司，陕西西安，710019）

竹材制浆企业多采用化学法制浆，其工业废水主要由蒸煮过程中产生的糖类、有机酸、氨基酸、类黄酮、单宁和光敏色素等组成[1]。化学竹浆废水组成复杂，且排放量大，浓度和色度高[2-4]，处理困难。一般使用物理、化学和厌氧、好氧联合的方法来处理造纸废水[5]，如絮凝沉淀[6]结合生物酶处理法[7]。随着科技水平的不断提升，对于工艺的研究亦不断深入，尽管当前已经取得了不错的进展，但受到技术水平的制约，尚有很多问题亟待解决；尤其是对关键的微生物群落结构了解还不够深入，使对此类废水的处理效率不能得到有效提升，从而使后端深度处理的成本偏高[8]。使用生物强化技术可提高难降解有机物的去除效率，对菌种进行筛选或将菌种进行基因改造形成高效降解菌并加入到系统内，可有效处理特定种类的有害物质。对于微生物群落结构的深入研究将有利于提高特征污染物的去除效率。

生物处理单元中复杂的微生物群落结构对于废水处理有指导作用，尤其是厌氧处理。邢雅娟等人[9]研究了UMIC 反应器微生物的纵向分布，发现细菌的多样性高于古菌，且反应器的空间维度也会影响微生物的菌落结构。易敏等人[10]比较了废纸制浆废水与蔗渣喷淋废水厌氧颗粒污泥中的微生物群落，结果表明细菌的种类和丰度受底物成分及周围理化环境（包括重金属成分）影响较大。郭建国等人[11]比较了芦苇制浆造纸废水的细菌群落变化，优势菌由γ变形菌和衣原体变为α变形菌，说明微生物群落构成及其多样性在不同的外界环境调控下会随时间进行动态演变。

Xia 等人[12]利用454 高通量测序，使用厌氧膜生物反应器和竹炭增强的厌氧膜生物反应器处理竹浆制浆废水的古菌群落，发现此系统中甲烷螺旋菌和甲烷细菌在甲烷生产中占主导地位；竹炭的增加提高了微生物多样性，促进了甲烷菌体的活性，提高了系统的COD 去除率和甲烷生成率。刘春等人[13]对EGSB 反应器处理竹浆制浆废水的过程和启动规律进行分析，但并未对群落结构进行解析。厌氧处理虽然起着重要作用，但好氧处理的出水水质决定着深度处理的成本。Liang 等人[14]以杨木化机浆制浆废水为目标，研究了EGSB 反应器和曝气活性污泥的微生物群落结构；在EGSB 反应器中，优势菌为Euryarchaeota，丰度为40.5%，曝气活性污泥的优势菌门为放线菌门和变形菌门，丰度分别为40.0%和28.6%。实际化学竹浆废水进水COD 较低，常见的处理方法为活性污泥法，处理率及成本受其菌群的复杂性及多样性影响较大，然而现阶段对化学竹浆废水活性污泥菌群结构及生物多样性的研究仍未见报道。

因此，本研究针对4 个不同化学竹浆废水处理厂样品，使用超高通量基因组454高通量测序技术，对其菌群结构及生物多样性进行研究，旨在为当前的微生物法处理难降解有机物中微生物种群结构调控提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

活性污泥取自4 个不同化学竹浆废水处理厂（永丰纸业股份有限公司、永丰浆纸股份有限公司、凤生纸业科技股份有限公司、金福纸品有限责任公司），处理工艺分别为水解+好氧、好氧（流量1200 m3/h）、好氧（流量800 m3/h）、ABR（厌氧折流板反应器）+好氧（以好氧为主），编号分别为1#～4#。化学竹浆废水CODCr含量为500～1500 mg/L，停留时间为24～32 h。具体指标如表1所示。

表1 化学竹浆废水主要水质指标和好氧单元工艺参数Table 1 Main water quality indexes and oxygen unit process parameters of chemical bamboo pulp wastewater

1.2 污泥细菌总DNA提取、PCR和16SrDNA测序

将样品在-20℃下冷冻保存，加干冰运输至上海美吉生物医药科技有限公司完成PCR（聚合酶链式反应）扩增和16SrDNA 测序。细菌总DNA 的提取工作利用E.Z.N.A.® soil 试剂盒完成；利用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物对V3-V4 可变区进行PCR扩增；扩增程序为95℃预变性3 min，27个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min（PCR 仪：ABI GeneAmp®9700 型）；扩增体系为20 μL，4 μL 5×FastPfu 缓冲液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 引物，0.4 μL FastPfu 聚合酶，10 ng DNA 模板。各样品进行PCR 扩增后，再通过Miseq PE300 进行测序。通过Trimmomatic 对原始序列数据进行操控，使用FLASH 软件进行拼接。使用UPARSE 软件，基于OUT 聚类使用97%的相似度对序列进行操作，之后在该过程中将单序列及嵌合体排除，利用RDP classifier将所有序列中的物种标注，并针对Silva 数据库（SSU123）进行考量，将比对阈值设为70%。

2 结果与讨论

2.1 细菌群落多样性分析

将1#～4#样品利用PCR 扩增和高通量测序后，得到的有效测序条带在29116～48573 之间。同时，为保证研究有效的细菌群落结构丰富度，对其中97%相似水平序列进行多样化研究，具体指标参照表2。由表2可知，4个样品的平均覆盖率均能达到99%以上，说明绝大多数菌群已经被检测出来。OUTs（Operational Taxonomic Units）值，反映各菌群样本的多样性高低水平[15]。本研究中4个样品生物分类单元OTUs分别为992、848、878 和692；Liang 等人[14]在研究杨木化机浆废水曝气反应器中的菌落结构时，得出其OUTs 达到1098，与本研究中1#样品的数值相当，说明竹浆废水和杨木化机浆废水中的菌群样本的多样性基本相当。香农指数是菌落多样性的另一个衡量参数[16]，其数值越高，则表示该样本菌群的微生物多样性越高；4 个样品香农指数分别为5.13、4.87、5.19和4.48，与OUTs 值所反映出的微生物多样性水平相一致。ACE 指数和Chao1指数均是衡量物种丰度的参数，即用来评估物种数目的多少，其数值越大，则表示其物种总数越多[17]。4 个样品的ACE 指数区间为767.80～1066.15，Chao1 指数区间为769.70～1048.37。这是由于不同的竹浆废水处理厂的处理手段和工艺不同，其群落多样性也具有明显的差异化。不同造纸原料产生的废水，由于进水水质的差异，进一步导致了微生物群落结构的差异显著化。

图1为细菌群落丰度稀释曲线图。由图1 可知，随着测序的不断增多，新菌群不断被发掘，因此OTUs（图1(a)）及香农指数（图1(b)）均有着较为明显的增加；在测序带数量超过20000 时，OTUs 稀释曲线末端出现一定程度地缓和，而香农指数稀释曲线不再发生明显变化，表明此次研究的序列深度能够对菌群结构进行有效描述。

图1 细菌群落丰度稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves of bacterial community abundance

表2 细菌群落多样性指数Table 2 Bacterial community diversity indices

针对细菌多样性指数和丰度稀释曲线进行分析可知，化学竹浆废水活性污泥细菌群落不同，且差异化较为明显。图2 为聚类分析热图及主成分分析图。聚类分析热图中，种属距离的远近用颜色的深度表示；其中距离的远近用红色及绿色代表，红色越深则说明距离越远则其相似度也越低。分析发现3#样品与其他3 种样品间均存在明显差异且差异值最为显著。而3#样品的香农指数也最大，说明3#样品的微生物不仅具有较高的多样性，而且种间差异较为显著。通过对主成分进行研究发现，所有样品菌落结构的分布均在3 个不同象限内，1#样品与4#样品位于同一象限，但距离相对较远，可充分说明其结构差距较为显著。菌落结构种间差异（种间距离）的大小也反应了水质成分的复杂程度，这主要是因为不同进水的污染负荷，经过物理水解酸化及厌氧处理后，使废水中的部分大分子物质变为小分子物质，进一步增加了废水成分的复杂程度，使各种菌属在不同污染物（部分作为微生物生长的抑制物）的不断选择驯化中，群落结构表现出很大程度的差异性。2#样品距离其他样品较远，且其进水CODCr值（表1）最高，进一步说明进水水质会直接影响细菌群落结构。

图2 细菌群落结构聚类分析热图和主成分分析图Fig.2 Cluster analysis and principal component analysis of bacterial community structure

2.2 细菌群落结构门水平上的组成和丰度

图3 细菌群落结构门水平上的组成Fig.3 Bacterial community composition at phylum level

通过RDP classifier软件对检测后的序列进行物种分类，图3 表示菌群结构在门水平上的组成和丰度。从图3可以看出，4个样品的优势门主要有变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和放线菌门，这与赵婷婷等人[18]的分析成果相似。在废水处理中，变形菌门具有重要作用，且其丰度在4个样品中的所有优势门中也最高（59.47%），因此得到了广泛关注[19-21]。绿弯菌门、拟杆菌门和放线菌门为活性污泥细菌群落结构中的优势门，其丰度分别为10.08%～21.66%、5.14%～18.34%、3.59%～18.86%；绿弯菌门在4个样品中的丰度分别为10.87%、21.66%、14.13%和10.08%，这与Mclellan等人[22]的研究结果一致。4 个样品中放线菌门丰度分别为4.03%、3.59%、18.86%和4.56%；厚壁菌门丰度分别为1.95%、1.18%、7.87%和0.36%，而有研究表明其在市政活性污泥中的丰度可达19%[23]。尽管已将4个样品中大部分细菌门类鉴定出，然而受技术水平限制，仍有部分门类未被鉴定出，其丰度占比分别为2.51%、1.84%、1.93%和0.89%。Liang 等人[14]对杨木化机浆废水好氧处理系统中的微生物群落进行分析，得出放线菌门的丰度为40.0%，变形菌门的丰度为28.6%；本文中放线菌门的丰度为55.89%，变形菌门的丰度为59.48%。因此同样是造纸废水，杨木化机浆与竹浆废水优势菌门类丰度具有较大差异。综上所述，竹浆废水与其他的造纸废水微生物菌落分布有本质区别，主要原因是原料不同而导致废水中碳源、氮源的比例不同，以及废水中不同抑制物对微生物种群具有特定选择性。

2.3 细菌群落结构目水平上的组成和丰度

在目水平上进行分类（每种目的丰度应至少保持在其中某一个样品大于1%），结果如表3 所示。结果表明，4个样品的前5类优势目不同，1#样品为Rhizobiales、Betaproteobacteriales、和Caulobacterales，丰度分别为18.79%、13.28%、8.61%、4.81% 和4.43%；2#样 品 为Calditrichales、Chitinophagales、Rhizobiales、Sphingobacteriales和Caldilineales，丰度分别为9.56%、9.37%、8.15%、6.88%和6.41%；3#样品为Betaproteobacteriales、Rhizobiales、Bacillales、Kineosporiales和Microtrichales，丰度分别为13.61%、13.52%、7.50%、5.71% 和4.05%；4#样 品 为Rhizobiales、Betaproteobacteriales、Chitinophagales、Sphingobacteriales和Methylococcales，丰度分别为23.96%、14.61%、8.30%、8.11% 和3.78%。虽然4 个样品共享了大多数的目，然其菌群结构存在明显差异，如优势目Rhizobiales丰度在4#样品中为23.96%，在1#样品中为18.79%，在2#样品中仅为8.15%。另外，Rhizobiales，Betaproteobacteriales、Chitinophagales在1#和4#样品中的丰度也基本一致。此结果与图2(b)菌落结构的种间差异的分析结果相吻合。

表3 细菌群落结构目水平上的组成和丰度Table 3 Bacterial community composition and abundance at order level %

从表1 的化学竹浆废水主要水质指标分析结果可以看出，1#和4#样品经水解和厌氧处理后进水的污染负荷较低，CODCr含量分别为500～800 mg/L 和500～1000 mg/L，生化处理后CODCr去除率较低。2#样品的进水污染负荷较高，CODCr含量为1100～1500 mg/L，生化处理后CODCr去除率较高，2 个优势目Calditrichales和Chitinophagales的丰度分别只占9.56%和9.37%。从图2（b）的菌落结构的种间差异（种间距离）分析可知，2#废水的菌落结构差异最为显著；因此进水特征性污染物的浓度及种类的差异可以引起进水CODCr含量的不同，从而导致水质的根本性差异。处理工艺、水质及其他因素（如进水原料和地理位置等）均可引起菌群结构的差异，其中废水水质是影响菌落组成的最关键因素[24-25]。

2.4 细菌群落结构属水平上的组成和丰度

在属水平上细菌群落结构的组成和丰度（每种属的丰度至少在一个样品中不小于1%）如表4 所示。从表4 可以看出，4 个样品共享的主要属为Hyphomicrobium、 Candidatus、 Competibacter、 JdFR-76 和SWB02。其中最大占比属为生丝微菌属，丰度为3.69%～18.29%，具有好氧反硝化作用[26]。尽管硝化螺菌属、Nordella、Terrimonas和Bacillus为非优势菌株，但被4个样品所共享。硝化螺菌属作为硝化细菌，可将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，从而促进生化系统的脱氮效率。Bacillus作为一种简易的细菌，其能够针对诸如碳系、氮系、磷系、硫系等污染物进行有效分解，也可分解蛋白质和复杂多糖，因此对于分解水溶性有机物有着显著作用[27]。核心属为生丝微菌属、SWB02、Bryobacter和Pedomicrobium，其中Pedomicro-bium可以降解多环类芳香族化合物，醇类及烷烃类物质[28-30]。可能是由于废纸中污染物相对复杂，存在相对较多芳香族化合物被富集吸收并降解。若要维持化学竹浆废水处理系统的稳定性，研究优势微生物的活性和多样化的群落结构间的相互关系有着至关重要的作用，其中构成活性污泥的微生物群体较为庞杂，深入探究多菌群的相互影响和协同作用污水处理最为关键的手段之一。

表4 细菌群落结构属水平上的组成和丰度Table 4 Bacterial community composition and abundance at genus level %

3 结论

3.1 不同化学竹浆废水好氧单元活性污泥中，微生物种群的结构差异主要由进水水质差异和处理工艺的不同，导致其不断演变而形成了菌落结构的多样性和差异性。

3.2 化学竹浆废水好氧单元活性污泥细菌菌群结构组成中的优势门为变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和放线菌门，变形菌门最高丰度为59.47%；核心属为生丝微菌属、SWB02、Bryobacter和Pedomicrobium，其中生丝微菌属占主导地位，丰度为3.69%～18.29%。这些菌属不仅与硝化、反硝化相关，还与多环芳香族类化合物，醇类及烷烃类物质的降解直接有关。