甲状腺球蛋白增高的先天性甲状腺功能减退症1 例报告并文献复习

王立彪 刘玉慧 相恒杰 黄文龙 陈文霞

河南中医药大学第一附属医院 国家儿童区域医疗中心（河南郑州 450000）

先天性甲状腺功能减退症（congenital hypothyroidism，CH）是新生儿和婴儿常见的一种内分泌系统疾病，发病率约1/2000～1/4000，其中由甲状腺球蛋白（thyroglobulin，TG）基因缺陷导致的CH患者较罕见，这类患者血清TG水平多降低或缺乏，但极少数患者TG水平升高。本文报告1个血清TG水平增高CH家系的临床资料。

1 临床资料

河南中医药大学第一附属医院收治的1例45日龄黄疸女婴。患儿系G 3 P 2，孕38 周顺产，出身体质量2 800 g，生后Apgar评分1分钟、5分钟均为10分，脐带、胎盘未见明显异常。患儿母亲孕期无高危因素，生后当天即出院。患儿生后正常开奶，奶量完成可。患儿生后3 天出现颜面皮肤黄染，具体胆红素值不详。家属自行给予益生菌口服治疗，黄疸逐渐加重。15 日龄时患儿仍全身皮肤黄疸，伴巩膜稍黄染，至当地医院经皮测胆红素为10.4 mg/dL，继续口服益生菌治疗。但黄疸消褪不理想，伴黄绿色糊状便，3 天1 次。当地医院查总胆红素208.9 μmol/L，直接胆红素12.4 μmol/L，白蛋白41.3 g/L，遂转入院。入院体格检查：神清，精神反应可，无特殊面容，全身皮肤黏膜轻度黄染伴巩膜稍黄染，心肺腹未见明显异常，神经系统无异常。入院实验室检查：游离三碘甲腺原氨酸（FT3）2.95 pmol/L，游离甲状腺素（FT4）0.01 pmol/L，促甲状腺素（TSH）354.75 mIU/L，甲状腺球蛋白（TG）377.68 ng/mL，抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPO-Ab）、抗甲状腺球蛋白抗体（TG-Ab）、促甲状腺受体抗体（TSHR-Ab）均无异常；血常规、C 反应蛋白、降钙素原（PCT）、肾功能、心肌酶、电解质、优生优育十项（弓形虫、巨细胞病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒1型及单纯疱疹病毒2型5种病原的IgG、IgM抗体）及EB病毒四项（EBV衣壳抗原IgG、EBV早期抗原IgG、EBV核抗原IgG、EBV 衣壳抗原IgM）等相关检查未见明显异常。甲状腺超声示甲状腺形态正常，无结节、囊肿。患儿诊断为CH。予左甲状腺素钠片替代治疗3 个月后，患儿甲状腺功能及甲状腺球蛋白恢复正常（FT 3 6.32 pmol/L，FT4 14.82 pmol/L，TSH 0.65 mIU/L，TG 3.02 ng/mL）。家族中无甲状腺相关疾病史，父母及哥哥均无异常（表1）。

因家属要求明确CH 原因及预测是否需终身服药，经医院医学伦理委员会批准以及家属知情同意后，用EDTA 抗凝采血管采集患儿兄妹及其父母外周血，送至北京金准基因科技有限责任公司进行相关基因检测。使用血液提取试剂盒（Blood DNA Kit V 2，CW 2553，康为世纪）提取基因组 DNA，并对基因组 DNA 进行质控。对DNA 样本进行超声破碎、文库构建、杂交捕获（SureSelect 杂交缓冲液体系，Agilent）及扩增、纯化，建立患儿的DNA目标基因捕获文库。后使用 Qubit dsDNA HS Assay kit（Invitrogen,Q32851）对测序文库的 DNA 样本进行定量。按照捕获文库DNA样本浓度及测序深度要求，使用Illumina HiSeq X Ten 平台进行测序，平均测序深度为 100×，获得fastq 格式的原始数据。使用Burrows-Wheeler Alignment（v0.7.15）工具将测序reads 比对到人类参考基因组（hg 19 版）。使用GATK（v 3.6）、CODEX、XHMM（v 1.0）、KSCNV（康旭开发）等软件检测单核苷酸变异（SNV）、小的插入缺失变异（InDel）及可能存在的拷贝数变异（CNV）。参考1000 G（V 1，V 3）、dbSNP、ESP 6500、ExAC、RefSeq、Ensembl、UCSC 等公共数据库，对变异信息进行注释。使用 PolyPhen-2、SIFT 和 MutationTaster2等软件对变异进行蛋白功能损伤预测。参考 OMIM、HGMD、ClinVar 等数据库，进行疾病信息注释。经 GERP++保守性分析和过滤，保留可能与疾病有关的变异。对各样本位点进行一代验证。在人类基因组数据库 GenBank 中获得上述变异位点基因序列，在引物设计网站Primer Z（http://genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/primerz 4 .do）设计引物并合成。对变异位点进行PCR扩增后行Sanger测序，将获得序列与之前的序列进行比对，排除二代测序中假阳性位点。

基因检测结果：在患儿TG 基因上发现2 个复合杂合变异，其中父源变异c.2149 C>T 导致编译第717 号氨基酸精氨酸（R）的密码子变为终止密码子（p.R 717*），从而导致肽链合成提前终止。根据美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南（ACMG）分类为疑似致病变异；母源变异c.5401+113 A>G 为剪切位点变异，可能影响mRNA剪接，ACMG分类为临床意义未明变异。患儿哥哥携带c.5401+113A>G单杂合变异，患者父母均为携带者，哥哥及父母的FT3、FT4、TSH、TG、TPO-Ab、TG-Ab、TSHR-Ab 检查结果正常且并无甲状腺功能减退相关症状。由于TG基因变异c.2149C>T及c.5401+113A>G在HGMD数据库中未见报道，为新发现的TG基因变异位点（图1、图2）。

2 讨论

CH 是新生儿和婴儿中常见的一种内分泌疾病，为常染色体隐性遗传，发病率约1/4000～1/2000，其中85%是由于甲状腺分化、迁移或生长异常（甲状腺发育不全）和促甲状腺激素抵抗引起，15%是由于甲状腺激素合成过程出现缺陷导致激素生成异常引起[1]。本例患儿的父母及哥哥均携带1个TG变异位点，无临床症状；患儿则为复合杂合变异，出现明显的甲状腺功能减退，符合常染色体隐性遗传方式。

表1 患儿家系临床表型

图1 TG 基因c.2149C ＞T 测序图

图2 TG 基因c.5401+113A ＞G 测序图

TG是一种相对分子质量为660 000的同型二聚体糖蛋白，仅在甲状腺中合成，是甲状腺激素生物合成的高度专门化基质，在甲状腺激素合成过程中TG 不仅为T3、T4合成提供骨架，同时可起到储存碘和甲状腺激素的作用[2]。TG 基因位于人类8 q 24.2-8 q 24.3染色体上，长度约270 kb，包含48个外显子，其结构异常可能导致TG 的合成或功能异常[3-5]。自1991 年首次报道TG基因变异可引起CH以来[6]，目前已发现100多种不同的TG基因变异类型[2,7]，但TG基因变异导致的CH仍较为罕见，发病率约为1/100 000[8]。

大多数由TG 基因变异而导致的CH 患者在左甲状腺素替代治疗前，不管是否存在甲状腺肿大，都显示出血清TG 水平降低或缺乏，这也是诊断TG基因缺陷的关键因素[7,9]。本例患儿出现极其罕见的临床表型，血清TG 水平不仅没有降低，反而升高。检索文献，除本例外，仅有4 例TG 升高的CH 患者的报道[10-12]。约80%的TG单体一级结构是三个连续的半胱氨酸（cysteine，Cys）重复结构域（重复结构域 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），剩余的20%（构成分子的羧基末端结构域）与乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）具有惊人的同源性，并且可能充当分子伴侣的作用。通常情况下，TG 基因变异可引起其转录产物不能正确的折叠，导致TG 蛋白在内质网的滞留，不能分泌到血液中，导致CH，此类患者多伴有甲状腺肿和内质网累积病[11,13]。未正确折叠的TG蛋白不能在细胞内运输，然后被伴侣蛋白通过未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）的细胞内信号通路重新折叠或降解[14]。文献报道的4 例TG 增高病例中，变异所致氨基酸改变p.G 2322 S 和p.A 2215 D 位于胆碱酯酶样（cholinesterase-like，ChEL）结构域中，p.C1995S位于Cys重复结构域Ⅲ中，均可引起TG错误折叠，并且在p.C 1995 S 伴TG 增高的病例中观察到缺乏伴侣蛋白激活，因而导致不完全的UPR 使错误折叠的TG释放入血，导致血清TG升高[10-12]。由此推测c.2149 C>T及c.5401+113 A>G 基因变异，可能引起TG 基因类似结构域改变，导致血清TG升高。此外CH患者甲状腺功能一般多表现为TSH增高，而既往4例病例中仅p.G2322S氨基酸改变者出现TSH增高，剩余3例TSH均未见明显异常。其中p.A 2215 D 氨基酸改变者为1 例男性患者，10 岁时因甲状腺肿大行部分甲状腺切除术，34 岁时再次因甲状腺肿大行甲状腺全切术，临床病理表现为滤泡增生，甲状腺碘摄取率明显升高，且经重组人TSH 刺激后血清TG 无明显升高；而p.C 1995 S 氨基酸改变者为2 例腺瘤性甲状腺肿的成年姐妹，甲状腺碘摄取率也明显升高。这3 例患者均考虑存在TG基因异常导致的CH，其中p.A2215D变异者变异的TG分子能够部分从内质网逃逸并合成少量的甲状腺激素，这或许可以部分解释为何携带TG基因变异的部分CH患者甲状腺功能仍为正常。

总之，发现TG 基因的两个新的变异，该复合杂合变异导致CH 患者血清TG 水平升高且不伴有甲状腺肿大，其原因可能与TG 折叠错误或不完全的UPR有关。