外周血JNK通路磷酸酶、Th1和Th17细胞比率检测在脓毒症中的临床应用

秦超，冯永海，张娆娆，卜克，王璐

(郑州大学第五附属医院 a.重症医学科；b.呼吸与危重症医学科，河南 郑州 410052)

脓毒症(sepsis)是一种由感染诱导异常宿主反应导致的致死性系统疾病，全球每年有上百万脓毒症患者[1]。脓毒症往往发病迅速，并且常并发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，病死率较高[2]。早期识别脓毒症风险及预后转归可在一定程度上增强脓毒症患者管理水平和降低死亡风险，因此积极探寻可能的生物标志物十分必要[3-5]。JNK通路磷酸酶[Jun N-terminal kinase (JNK) pathway-associated phosphatase，JKAP]既往被发现可以通过调控Th1、Th17细胞分化及炎症因子的释放，从而参与多种炎症性或感染性疾病的发病和进展[6-7]。此外，JKAP还被报道在脓毒症患者中异常表达[8]。然而，在脓毒症患者中JKAP与Th1及Th17细胞的关联，以及它们作为脓毒症患病风险和预后标志物的潜能，尚不清楚。因此，本研究旨在探讨脓毒症患者中外周血JKAP水平与Th1、Th17细胞的关联，以及它们与脓毒症发病和死亡风险的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象本研究连续纳入于2019年1月至2020年12月在郑州大学第五附属医院就诊的79例脓毒症患者。入组标准：(1)符合2016年国际脓毒症会议制定的Sepsis 3.0诊断标准[9]；(2)年龄满18周岁；(3)于症状出现后24 h内入重症医学科治疗。排除标准：(1)合并恶性血液疾病或肿瘤；(2)3个月内接受过化疗；(3)伴有自身免疫性疾病；(4)长期使用免疫抑制剂或抗生素；(5)孕妇或哺乳期妇女。入组患者的平均年龄为(54.8±12.4)岁；男49例(62.0%)，女30例(38.0%)；平均体质量指数(body mass index，BMI)为(23.4±3.7) kg·m-2；有吸烟史26例(32.9%)、饮酒史32例(40.5%)、高血压史33例(41.8%)、高脂血症史18例(22.8%)、糖尿病史13例(16.5%)、慢性肾病史10例(12.7%)、心脑血管史20例(25.3%)；主要感染部位包括腹部33例(41.8%)、呼吸道15例(19.0%)、皮肤和软组织14例(17.7%)、血液感染9例(11.4%)、中枢神经系统4例(5.1%)、其他部位4例(5.1%)；血液培养结果为革兰阴性菌感染43例(54.4%)、革兰阳性菌感染17例(21.5%)、厌氧菌感染9例(11.4%)、真菌感染3例(3.8%)、支原体感染5例(6.3%)、阴性18例(22.8%)。患者中位血清肌酐(serum creatinine，Scr)水平为1.4 mg·dL-1(四分位区间：0.9～2.01 mg·dL-1，中位白蛋白(albumin，ALB)水平为27.0 g·L-1(四分位区间：21.6～38.8 g·L-1)，中位白细胞计数(white blood cell，WBC)水平为16.5×109L-1(四分位区间：11.2～26.5×109L-1)，中位C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平为86.8 mg·L-1(四分位区间：48.0～131.9 mg·L-1)。患者入院24 h内的急性生理与慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ)评分中位值为13.0(四分位区间：8.0～17.0)，序贯器官衰竭评估(sequential organ failure assessment，SOFA)评分中位值为5.0(四分位区间：4.0～8.0)。此外，本研究纳入于2020年7月至2020年12月在郑州大学第五附属医院行体检的80例健康受试者(年龄和性别与已入组患者匹配)作为对照组。健康受试者平均年龄为(53.7±11.9)岁；男28例(35.0%)，女52例(65.0%)；平均BMI为(22.9±2.9)kg·m-2；有吸烟史21例(26.3%)、饮酒史35例(43.8%)；中位Scr水平为0.8 mg·dL-1(四分位区间：0.7～1.0 mg·dL-1)，中位ALB水平为42.6 g·L-1(四分位区间：39.1～47.4 g·L-1)，中位WBC水平为6.4×109L-1(四分位区间：5.4～7.5×109L-1)，CRP水平为3.6 mg·L-1(四分位区间：2.4～6.4 mg·L-1)。本研究已获得医院伦理审查委员会批准，且所有患者已提供书面知情同意。

1.2 血液样本收集和处理所有脓毒症患者入院后，使用真空采血管采集外周血液样本。健康受试者的外周血液样本于体检时采集。所有血液样本在采集后，立即通过离心分离获得血清样本，通过梯度密度离心分离方法并使用Ficoll®PM 400(Sigma，USA)试剂分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。分离后的血清样本以及PBMC样本均保存在超低温冰箱中待后续检测使用。

1.3 酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)在血清分离后的24 h内，采用人JKAP ELISA 试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，中国)检测血清样本中JKAP的水平；分别采用人肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA试剂盒(invitrogen，USA)、人白介素β(interleukin beta，IL-β)ELISA试剂盒(invitrogen，USA)以及人白介素17(interleukin 17，IL-17)ELISA试剂盒(Invitrogen，USA)检测血清中TNF-α、IL-β以及IL-17的水平，所有ELISA实验操作过程均严格按照试剂盒厂家说明书执行。

1.4 流式细胞术分析在PBMC分离后的24 h内，采用Human Th1/Th17 Phenotyping Kit (BD PharmingenTM，USA)中的特异性荧光抗体标记CD4阳性T细胞以及Th1、Th17细胞，然后使用流式细胞仪对被标记的细胞进行流式计数，最终计算出Th1和Th17细胞在CD4阳性T细胞中的比率。具体操作步骤均严格按照试剂盒厂家说明书执行。

1.5 28 d死亡率评估对所有脓毒症患者密切观察随访至死亡或直至28 d，记录28 d内的死亡情况，并评估28 d死亡率。

1.6 统计分析变量分布特征采用均值、标准差、中位值、四分位值以及例次百分比进行描述。连续变量两组之间的比较分析采用Wilcoxon秩和检验。连续变量间的关联采用Spearman秩相关分析。变量对于不同受试者的区分作用采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线以及曲线下面积(area under the curve，AUC)来评估。使用SPSS 24.0(IBM，USA)软件进行统计分析，用GraphPad Prism 7.01软件(GraphPad Inc.，USA)进行绘图。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 JKAP、Th1、Th17在脓毒症患者中的异常水平与对照组相比较，脓毒症患者JKAP水平降低[26.5(14.8～43.8)ng·L-1比98.6(53.5～145.5)ng·L-1，P<0.001](图1 A)，Th1[13.6%(11.9%～18.6%)比9.2%(7.9%～11.0%)，P<0.001]和Th17[3.3%(2.0%～4.9%)比1.8%(1.5%～2.0%)，P<0.001]细胞比率升高(图1 B～C)。进一步ROC曲线分析表明，JKAP(AUC：0.904，95% CI：0.860～0.949)、Th1细胞(AUC：0.897，95% CI：0.849～0.944)、Th17细胞(AUC：0.804，95% CI：0.728～0.879)水平均可以较好地区分脓毒症患者和对照组患者(图1 D～F)。

图1 JKAP、Th1和Th17在健康受试者与脓毒症患者中的差异以及ROC曲线分析

2.2 脓毒症患者中JKAP与Th1、Th17的关联性脓毒症患者中，JKAP水平与Th1细胞比率(P<0.001)和Th17细胞比率(P<0.001)均呈负相关(表1)。JKAP水平与炎症因子TNF-α(P=0.008)、IL-1β(P=0.006)和IL-17(P=0.010)呈负相关(表1)。

表1 JKAP与Th1、Th17、TNF-α、IL-1β和IL-17的关联性

2.3 脓毒症患者中JKAP与常见生化指标及疾病综合评分的关联性脓毒症患者中，JKAP水平与Scr(P<0.001)、WBC(P<0.001)及CRP(P<0.001)水平呈负相关，与ALB呈正相关(P<0.001)(表2)。JKAP水平与疾病综合评分APACHE Ⅱ(P<0.001)和SOFA(P<0.001)呈负相关(表2)。

2.4 脓毒症患者中JKAP、Th1、Th17与死亡风险的关联性JKAP水平在脓毒症死亡患者中低于生存患者[20.1(8.2～24.2)ng·L-1比32.8(18.2～49.3)ng·L-1，P<0.001](图2 A)，Th1[18.2%(14.9%～23.1%)比13.1%(11.6%～17.2%)，P=0.001]和Th17[5.8%(3.2%～9.5%)比2.9%(1.8%～4.0%)，P=0.001]细胞水平在脓毒症死亡患者中高于生存患者(图2 B～C)。此外，进一步ROC曲线分析表明，JKAP(AUC：0.799，95% CI：0.697～0.901)、Th1细胞(AUC：0.759，95% CI：0.636～0.882)、Th17细胞(AUC：0.763，95% CI：0.632～0.894)水平均可以预测脓毒症患者死亡风险(图2 D～F)。

表2 JKAP与生化指标和疾病严重程度的关联性

图2 JKAP、Th1和Th17在脓毒症生存患者与死亡患者中的比较以及ROC曲线分析

3 讨论

本研究通过检测脓毒症患者外周血中JKAP、Th1和Th17细胞水平，发现他们不仅在脓毒症患者中异常表达，并且有作为脓毒症患者死亡风险标志物的潜能。此外，脓毒症患者中JKAP水平与Th1和Th17细胞水平高度相关，并且还与患者系统性炎症水平和疾病严重程度相关，进一步表明JKAP作为脓毒症生物标志物的潜能及可能机制。

JKAP在调控多种免疫和炎症性反应中均有着重要作用。一项既往研究报道，JKAP可以通过调控CD4+T细胞分化及炎症因子参与系统性红斑狼疮的发病和进展[7]。另外一项研究报道，JKAP可以通过激活CD4+T细胞并促进其向Th1和Th17分化，并同时调控炎症因子，从而参与炎症性肠病的疾病进展[6]。此外，JKAP还被报道与克罗恩病低的患病风险、炎症水平和疾病活动度相关[10]，并且其与哮喘患儿低的炎症水平和急性发作风险亦相关[11]；再者，JKAP还被发现有作为类风湿性关节炎和幼年特发性关节炎患病风险、炎症和疾病活动度标志物潜能[12-13]。至于JKAP在感染性疾病中的应用，仅有一篇研究报告JKAP在脓毒症患者中异常表达[8]。以上研究均表明，JKAP有作为炎症性/感染性疾病生物标志物的潜能。本研究进一步发现了JKAP在脓毒症患者中低表达，并且可以较好地对脓毒症患病风险起到预测作用，这与既往报道结果一致。此外，本研究还发现JKAP水平与脓毒症患者炎症水平和疾病严重程度呈负相关。可能的解释原因有：(1)JKAP通过调控Lck通路和MAPK通路从而阻断T细胞信号传导通路，调节多个下游炎症因子，从而抑制脓毒症患者炎症水平并制止疾病的恶化[14-15]；(2)JKAP抑制CD4+T细胞的激活，并阻碍Th1和Th17细胞分化及对应炎症因子的释放，从而降低脓毒症患者炎症水平和疾病严重程度[6-7]；(3)JKAP与脓毒症患者少/轻的器官损伤相关(与肝肾功能指标等关联体现)，从而间接影响脓毒症患者疾病的严重程度。

关于Th1和Th17细胞在脓毒症中的调控作用，已经有较多研究报道。例如，研究发现Th1细胞和Th17细胞在感染性疾病尤其是脓毒症患者中呈现高水平[16-17]。本研究也发现Th1和Th17在脓毒症患者中表现出高水平，这与既往研究一致。此外，本研究还发现脓毒症患者中JKAP水平不仅与Th1细胞水平相关，还与Th17细胞水平相关，暗示脓毒症患者中JKAP也参与了Th1和Th17的调控。可能解释原因为JKAP可能通过调节Lck通路和MAPK通路，抑制T细胞信号传导，弱化CD4+T细胞激活及Th1、Th17细胞分化[6-7,14-15]。

关于JKAP、Th1和Th17水平在脓毒症中的预后作用，目前少有研究报道。本研究进一步分析发现，JKAP在脓毒症死亡患者中低表达，而Th1和Th17细胞在脓毒症死亡患者中呈现高水平，并且三者均可以在一定程度上预测脓毒症患者的死亡风险，这进一步表明JKAP作为脓毒症预后生物标志物的潜能及可能机制。可能原因有：(1)JKAP通过抑制Th1和Th17分化，降低脓毒症患者系统性炎症及疾病严重程度，从而降低脓毒症患者死亡风险[6-7,14-15]；(2)JKAP还可以通过降低脓毒症多器官损伤(与肝肾功能指标等关联体现)，从而降低其死亡风险。

本研究存在一些不足：(1)本研究样本量较低，可能导致低的统计效能，因此将来需进一步执行大样本研究以验证本研究结果；(2)本研究患者主要来自单个地区，因此可能存在患者选择偏倚，因此将来进一步跨地域多中心研究是必要的；(3)本研究评估了患者的28 d死亡率，而JKAP、Th1和Th17在脓毒症患者长期预后中的作用，需要进一步探索。

综上所述，JKAP与Th1、Th17细胞高度相关，并且有作为脓毒症患病风险、疾病严重程度监控及短期预后生物标志物的潜能。