化学发光免疫分析技术在新型冠状病毒肺炎辅助诊断中的应用价值

吴联朋 朱守宽 毛婷婷 李焕铮 唐少华

目前，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测是诊断新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的金标准，但存在假阴性等问题。随着对SARS-CoV-2研究的深入，国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》[1]中提出应用SARS-CoV-2抗体检测可作为COVID-19的辅助诊断。本研究采用化学发光免疫分析技术（chemiluminescent immunoassay,CLIA）检测SARSCoV-2的IgM和IgG抗体，评估其在COVID-19辅助诊断中的应用价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2020年1月31日至3月16日温州市中心医院收治的COVID-19住院患者66例（阳性组），其中男 33例，女 33例，平均年龄（46.65±14.28）岁。根据临床诊断和SARS-CoV-2核酸检测结果阳性确诊为COVID-19。选取同期本院根据临床诊断和SARS-CoV-2核酸检测排除COVID-19的发热患者50例（对照组），其中男25例，女25例，平均年龄（43.80±16.37）岁。两组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准（批件号：L2020-01-059），且所有患者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 iFlash3000全自动化学发光免疫分析仪及其配套的SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体化学发光检测试剂盒（深圳亚辉龙生物科技股份有限公司，批号：20200202），磁珠法核酸提取试剂盒（宁波海尔施基因科技公司，批号：200129001），SARS-CoV-2ORF1ab/N基因双重核酸检测试剂盒（上海伯杰医疗科技有限公司批号：20200125E），全自动核酸提取仪（台湾圆点奈米技术股份有限公司），7500型荧光PCR仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.3 标本采集 采集两组患者清晨空腹静脉血3～5 ml，置于含分离胶的红盖真空采血管内，静置待血液凝固后，2 500 g离心5 min，排除溶血、脂浊等因素的干扰后取血清备用，其中66例阳性患者不同病程血清样本179份，50例阴性患者血清样本50份。同时采集两组患者鼻咽拭子或深部咳痰标本进行SARS-CoV-2核酸检测。

1.4 CLIA检测 血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测采用全自动化学发光免疫分析仪，检测步骤参照仪器标准操作规程，测试结果以相对发光强度（relative light unit,RLU）表示。样本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗体量和RLU之间呈正相关，测定仪根据RLU及内置校准曲线自动计算出SARS-CoV-2 IgM或IgG抗体浓度（AU/ml），以检测结果≥10.0 AU/ml为有反应性（阳性），＜10.0 AU/ml为无反应性（阴性）。

1.5 SARS-CoV-2核酸检测 采用荧光RT-PCR技术，针对SARS-CoV-2基因组中开放读码框1ab（open reading frame 1ab,ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsid protein,N）按试剂盒说明书进行检测。靶基因检测判读和SARS-CoV-2核酸检测阳性判读以厂家说明书建议为准，对可疑结果通知临床重新采样复查。实验室检测结果确诊为阳性需满足同一份标本中SARSCoV-2的ORF1ab及N基因检测同时阳性，或同一患者不同的两份标本中SARS-CoV-2的ORF1ab或N基因检测阳性。

1.6 统计学处理 采用SPSS Statistics 22.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。计算CLIA检测SARS-CoV-2 IgM抗体、IgG抗体以及两者联合检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。统计不同病程IgM、IgG和两者联合检测的阳性率（用样本采集日期减去症状出现日期得到患者的发病天数），采用Excel 2016软件对发病天数、IgM、IgG和两者联合检测结果进行统计分析。

2 结果

2.1 CLIA检测SARS-CoV-2抗体结果分析 SARSCoV-2 IgM抗体检测灵敏度为57.54%（103/179），特异度为 92.00%（46/50），阳性预测值为 92.26%（103/107）,阴性预测值为37.70%（46/122），符合率为65.07%（149/229）。SARS-CoV-2 IgG抗体检测灵敏度为88.27%（158/179），特异度为96.00%（48/50），阳性预测值为98.75%（158/160），阴性预测值 69.57%（48/69），符合率为89.96%（206/229）。SARS-CoV-2 IgM联合IgG抗体检测灵敏度为88.83%（159/179），特异度为88.00%（44/50），阳性预测值为96.36%（159/165），阴性预测值68.75%（44/64），符合率为 88.65%（203/229）。见表 1。

表1 CLIA检测SARS-CoV-2抗体结果分析（份）

2.2 不同病程SARS-CoV-2抗体检测结果分析 将66例确诊COVID-19患者的179份血清样本按病程分为 0～7 d、8～14 d、15～21 d、22～28 d、29～35 d、36～42 d、＞42 d 7个组，CLIA检测SARS-CoV-2 IgM、IgG、联合检测IgM和IgG抗体的阳性率见表2。IgM抗体从发病的0～7 d开始检出，随着病程的进展阳性率逐渐升高，在22～28 d到达峰值，检出率为90.91%，此后阳性率逐渐下降，＞42 d后阳性率下降至23.32%。IgG抗体同样也在0～7 d开始检出，在22～28d到达峰值，检出率达到100%。不同于IgM抗体，IgG抗体阳性率在病程的29～35 d、36～42 d、＞42 d 依旧保持在较高水平。IgM 和IgG抗体联合检测阳性率和单独检测IgG相仿。

表2 不同病程SARS-CoV-2抗体检测结果分析[份（%）]

3 讨论

SARS-CoV-2是一种新型β属冠状病毒，属正冠状病毒亚科，是继SARS-CoV和 MERS-CoV等6种冠状病毒之后，可以感染人类的第7种冠状病毒[2-5]。

2020年1月20日，中国疾病控制中心（CDC）宣布将该病纳入国家“乙类”传染病，采取“甲类”传染病防控措施。对疑似患者及时准确地诊断，尽早隔离收治，是防控的重要环节。目前，SARS-CoV-2核酸检测是诊断COVID-19的常用方法和金标准，但是SARS-CoV-2核酸检测结果为假阴性的情况不断地被提及，这其中与样本采集的质量，病毒RNA易降解，标本的前处理方式方法、病毒存在变异、核酸试剂盒本身质量问题等因素相关[6]。随着对SARS-CoV-2认识和探索的不断深入，血清抗体检测已经成为COVID-19的一种辅助诊断方式。

目前，中国有多家试剂厂家研发出针对SARSCoV-2 IgM和IgG抗体的免疫检测试剂盒，其中包括胶体金法和CLIA。而CLIA具有灵敏度高、线性范围宽、高通量、操作简单等优点，已经普及到对人类免疫缺陷病毒、梅毒等病原体抗体的临床检测当中[7]。SARSCoV-2是一种全新的病毒，且体外抗体检测不可避免地存在假阳性和假阴性的问题，所以CLIA的检测灵敏度和特异度有必要进行充分验证。本研究结果显示，CLIA检测SARS-CoV-2 IgM抗体诊断COVID-19的灵敏度、特异度分别为57.54%、92.00%，检测IgG抗体诊断COVID-19的灵敏度、特异度分别为88.27%、96.00%，和徐万洲等[6]研究结果相接近，提示了CLIA检测SARS-CoV-2抗体在诊断COVID-19方面有良好的灵敏度和特异度，且重复性较好。

当病原体感染人体后，人体免疫系统会对病原体进行免疫防御并产生特异性抗体。IgM抗体通常在1周内产生，提示有近期感染。IgG抗体晚于IgM抗体出现，但由于在体内能存在较长时间，检测可鉴别急性感染和既往感染[8]。本研究结果显示，SARS-CoV-2 IgM抗体从发病的0～7 d开始产生，随着病程的进展阳性率逐渐升高，在22～28 d到达峰值，检出率达90.91%，此后阳性率逐渐下降，在36～42 d还保持53.85%的阳性率，超过42 d后则下降至23.32%，说明部分患者超过6周后体内IgM抗体还存在，具体IgM抗体多久会消失则需要更长时间的随访检测。IgG抗体同样也在0～7 d开始检出，在22～28 d到达峰值，检出率达到100%，直至42 d依旧保持着94.59%的阳性率，说明了SARS-CoV-2 IgG抗体在体内存在更久，但滴度是否逐渐降低则需要更多检测结果验证。本研究中IgG抗体阳性率全程大于IgM抗体，在病程的中后期不难理解，但在病程早期的0～7 d同样是IgG大于IgM，或许和检测方法本身的灵敏度相关。

CLIA检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体只需110 μl血清标本，标本较为容易获得，同时操作较为简便，对实验室环境、设施等要求比PCR实验室低，实验室人员面对的风险较核酸检测低，从上机检测到出结果需要大约40 min，可作为疑似患者核酸检测阴性时的一种补充检测，或与核酸检测协同使用诊断疑似SARSCoV-2感染者[9]。CLIA又是一种定量的检测技术，相比核酸检测与胶体金法抗体检测等定性方法，可以数字化更直观地呈现患者体内抗体的浓度，不仅可以辅助诊断COVID-19，对患者的治疗效果监测和病程预后评估有重要的提示作用。

综上所述，CLIA检测SARS-CoV-2抗体具有良好的灵敏度和特异度，在病程的22～28 d检测阳性率最高，该方法简便、快捷，对COVID-19有辅助诊断价值。