钙敏感受体在大剂量瑞芬太尼诱导卵巢癌裸鼠心肌损伤中的作用机制研究

朱烨静 周惠丹 崔小英 钱琳艳 方军 姜慧芳 许宏亮

作为妇科恶性肿瘤中恶性程度最高的卵巢癌，约70%发现时已是晚期[1]。而卵巢癌根治术创伤大、时间长，使患者在手术及术后发生心血管不良事件的风险大大增加。瑞芬太尼作为起效迅速、镇痛效果确切的一种阿片类药物，既能确保手术过程中镇痛效果良好，又能在手术结束后迅速消散，但手术中大剂量长时间输注会出现心肌抑制的不良反应。有研究发现，大剂量瑞芬太尼能增加大鼠心肌氧化应激，且随着剂量的增加和输注时间的延长，心肌损伤程度也不断加重[2]。但目前对大剂量瑞芬太尼抑制心肌机制的研究甚少。因此，本研究旨在探讨钙敏感受体（calciumsensing recetor,CaSR）在持续大剂量输注瑞芬太尼诱导卵巢癌裸鼠心肌损伤中的作用机制及信号通路，以期为防治大剂量阿片类药物的心肌抑制作用提供有效的靶点。

1 材料和方法

1.1 实验动物和材料 Nc-nu裸鼠40只（6～8周，20～25 g）[中国科学院上海实验动物中心，许可证号：SCXK（沪）2016-2017]；瑞芬太尼（1 mg/支，国药准字：90A08061，湖北宜昌人福药业公司）；人卵巢癌细胞株SKOV3（广州富恒生物），CaSR 抗体（200 μg/支，美国 Cell Signaling公司）；蓬乱蛋白同源物（Dvl-1）抗体和βactin（1 mg/支，美国 Santa Cruz公司），β 连环蛋白（βcatenin）抗体（1 mg/支，美国 Santa Cruz公司）；CaSR 抑制剂 Calhex231（1 mg/瓶，美国 Santa Cruz公司）；蛋白裂解缓冲液（北京索莱宝公司）；蛋白酶抑制剂（PMSF）和辣根过氧化物酶（HRP）（上海碧云天公司）；肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（南京建成生物医学工程研究所）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型制备 将40只裸鼠按随机数字表法分为空白对照组（C组）、模型对照组（O组）、瑞芬太尼输注组（R组）和瑞芬太尼+CaSR拮抗剂Calhex231组（R+C组），每组10只。除C组外，O组、R组、R+C组均进行卵巢癌模型构建：将人卵巢癌细胞株SKOV3（卵巢浆液性乳头状腺癌）培养于含10% FBS、100 U/ml青霉素和 100 U/ml链霉素的 RPMI-1640培养液中，37℃、5% CO2孵箱中孵育，选用对数生长期细胞，经胰酶消化，制备成107个/ml的悬浮液，在每只裸鼠腋部皮下进行注射，皮下移植瘤呈囊形，15 d后基本成瘤，表示建模成功。模型建立后，R组泵注瑞芬太尼20 μg（/kg·min）持续1 h，R+C组尾静脉注射浓度为10-3mol/L的 Calhex231（每100 mg给予0.1 μl），48 h后泵注瑞芬太尼20 μg（/kg·min）持续1 h；C组、O组均输注等量0.9%氯化钠注射液。

1.2.2 标本采集 注射上述药物后，即刻于裸鼠内眦静脉内取尽血，2 500～3 000 r/min离心5 min，取上层血清备用。断颈处死裸鼠，取部分心肌组织，4%多聚甲醛中室温固定18～24 h。

1.3 观察指标

1.3.1 血清 CK、LDH水平测定 采用酶联免疫法检测血清中CK和LDH水平。操作按试剂盒说明书进行。

1.3.2 心肌组织常规病理检查 心肌组织常规石蜡包埋，3～5 μm切片，以备HE染色使用。将石蜡切片从4℃冰箱中取出后凉干，60℃烤箱中加热，二甲苯中脱蜡3次，依次梯度乙醇逐级浸泡，自来水洗，浸入苏木精染液3～5 min染核，弱碱性水溶液显蓝30～60 s；0.5%伊红染色 2～3 min，蒸馏水洗 1～2 s，梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，并用中性树胶封片，光镜下观察各组裸鼠心肌细胞损伤情况。

1.3.3 CaSR及Dvl-1、β-catenin蛋白表达检测 剩余心肌组织，存储-80℃冰箱以备提取蛋白使用。采用免疫组化法检测CaSR表达及分布情况，蓝染为细胞核，细胞质及膜呈棕色为CaSR表达。采用Western blot检测CaSR、Dvl-1、β-catenin蛋白表达：按每100 mg组织加入150～200 ml蛋白裂解缓冲液及PMSF，充分混匀，4℃下放置40 min，12 000 r/min 4℃离心20 min，取上清液进行蛋白定量。按步骤配胶、上样、电泳、转膜等，一抗 CaSR（1∶500）、Dvl-1（1∶200）、β-catenin（1∶1 000）和 β-actin（1∶500）4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜，将膜放入HRP标记的二抗（1∶5 000）中室温孵育30 min，ECL显色。应用Image J软件对图片中条带进行灰度测量，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参灰度值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，方差齐性两两比较采用LSD-t检验，方差不齐采用 Dunnett's T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组裸鼠血清CK和LDH水平的比较 与C组及O组相比，R组裸鼠血清CK和LDH水平升高（均P＜0.05），而R+C组无明显变化（P＞0.05）。与R组相比，R+C组血清CK和LDH水平均明显降低（均P＜0.05）。见表1。

表1 4组裸鼠血清CK和LDH水平的比较（U/L）

2.2 4组裸鼠心肌细胞形态学的变化 光镜下可见C组心肌细胞形态排列正常，条纹清晰，肌纤维粗而长，细胞核中染色质疏松，密度均匀；O组心肌细胞形态排列尚可，少量炎细胞浸润；R组心肌组织进行性纤维化为特征，表现为心肌细胞肿胀，心肌间隙增宽，肌纤维排列紊乱，横纹不清晰；R+C组心肌细胞排列略紊乱，少量炎细胞浸润，散在的单个心肌细胞表现为局部肌浆溶解和空泡，而邻近的心肌细胞仍正常，无明显纤维化表现，见图1（插页）。

图1 4组裸鼠光镜下心肌细胞形态学的变化（HE染色，×200）

2.3 4组裸鼠心肌细胞CaSR表达及分布情况 光镜下可见C组及O组细胞核蓝染，形态排列尚可，少量细胞显示棕色；R组炎细胞浸润和肌纤维排列紊乱同时，CaSR大量分布细胞质及细胞膜；而R+C组心肌细胞质少量棕色，形态排列略紊乱，但无明显纤维化改变，见图 2（插页）。

图2 4组裸鼠心肌细胞钙敏感受体（CaSR）表达及分布情况（免疫组化，×200）

2.4 4组裸鼠心肌细胞CaSR、Dvl-1、β-catenin表达的比较 与 C组及 O组比较，R组中 CaSR、Dvl-1和β-catenin表达明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而R+C组心肌组织CaSR、Dvl-1和β-catenin表达无明显增加，但与R组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3。

图3 4组裸鼠心肌细胞上钙敏感受体（CaSR）、蓬乱蛋白同源物（Dvl-1）、β连环蛋白（β-catenin）表达情况（a：各组心肌组织中CaSR、Dvl-1、β-catenin 蛋白电泳图；b、c、d：各组心肌组织中 CaSR、Dvl-1、β-catenin 蛋白相对表达量；与 C 组比较，*P＜0.05；与 O组比较，▲P＜0.05；与 R 组比较，△P＜0.05）

3 讨论

卵巢癌在我国年发病率居女性生殖系统肿瘤第3位，且呈逐年上升的趋势，目前手术及化疗是卵巢癌治疗的主要手段。而对于此类手术，创伤大，时间长，术中长时间输注阿片类药物，使患者容易在围术期发生心血管不良事件。有研究发现，术中短时间平均动脉压低于55 mmHg，可能发生心肌损伤及急性肾损伤[3]。因此，对于需要进行手术的卵巢癌患者来说，无疑增加了其心肌损伤的程度和猝死的风险。

瑞芬太尼是一种人工合成的新型高选择性μ受体激动剂，能迅速被血浆非特异性酯酶水解，具有起效快、镇痛作用强、清除半衰期短、无蓄积、代谢不受肝肾功能的影响等优点，目前广泛应用于临床麻醉。有关瑞芬太尼对心肌的影响目前存在“保护”、“损伤”双向性争议：有研究认为瑞芬太尼对缺血再灌注的心肌具有保护作用[4-5]；也有学者发现大剂量瑞芬太尼则能增加大鼠心肌氧化应激，随着给药时间的延长，心肌损伤程度不断加重[2]。尽管不同研究显示瑞芬太尼对心脏的影响具有两面性，但大剂量长时间使用时对心肌损伤的不良反应不容小觑。本研究卵巢癌裸鼠进行大剂量瑞芬太尼输注，发现血清CK及LDH水平增加，与C组及O组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），提示给予一定大剂量的瑞芬太尼，可引起心肌细胞不同程度的损伤，同时HE染色提示，瑞芬太尼组炎细胞浸润明显，心肌细胞肿胀，形态排列紊乱，这些结果都提示大剂量瑞芬太尼可以导致一定的心肌损伤。而给予CaSR抑制剂后，再输注同样剂量瑞芬太尼后，CK和LDH水平并没有明显增加，少量心肌炎细胞浸润，形态排列尚可，说明CaSR可能参与了大剂量瑞芬太尼诱导心肌损伤的病理过程。

CaSR是G蛋白耦联受体的C家族成员之一，在多种细胞内均有广泛分布。近年来发现 CaSR涉及了多种分子信号通路，在不同器官和组织中发挥生理病理作用。有研究报道，CaSR激活后，能介导线粒体通路、Fas死亡受体通路和内质网应激通路，诱导心肌细胞凋亡[6-8]。同时也有研究发现，CaSR能使NLPR-3炎症小体活化，继而介导了Caspase-1依赖的心肌细胞焦亡分子通路的激活[9-10]。本课题组之前研究发现CaSR上调可以介导MAPK途径的激活引起心肌细胞凋亡[11]。因此可以肯定，CaSR作为心肌细胞内信号激活，通过细胞间信号通路汇集、呈递、交互对话的调节，参与了心肌细胞损伤的过程。本研究结果也显示，CaSR在瑞芬太尼诱导卵巢癌裸鼠心肌损伤过程中，起到了一定作用。因此，笔者将继续探寻其相关的分子机制。

Wnt信号通路作为一条潜在、重要的信号转导通路，在心肌肥厚、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生、发展中发挥重要的作用[12-13]。Wnt/β-catenin信号途径被誉为“经典Wnt信号途径”：当Wnt信号出现后，被激活的Dvl和Fz受体相结合，启动了下游相应的通路。LRP-5/6与支架蛋白Axin结合，解离了GSK-3β复合物，使β-catenin无法降解而在细胞胞内大量聚集，并转位入核，激活了转录因子如TCF/LEF，从而引起下游靶基因如c-Myc、cyclin等转录表达，产生相应的功能效应[14]。Martin等[15]研究发现激活Wnt通路后可引起心肌细胞的肥大。Zhang等[16]研究发现调控Wnt通路和心肌病的发生有关。Malekar等[17]研究发现在Dvl-1过表达的转基因小鼠模型中，Dvl-1过表达可导致严重的心肌肥厚，射血分数降低，心脏重量增加，同时在主动脉结扎和心力衰竭诱导的心肌肥厚模型中Dvl-1的表达也增加，而Dvl-1敲除的小鼠心肌细胞β-肾上腺素诱导的心肌肥厚效应消失，证实Dvl-1作为交互对话的重要分子，起着承接Wnt信号通路的关键枢纽作用。本课题组前期也证实，敲除Dvl-1基因后，能抑制心肌凋亡，减轻心肌损伤[18]。本研究中，大剂量使用瑞芬太尼后，裸鼠心肌细胞中CaSR表达上调，同时Dvl-1和β-catenin表达增加，而CaSR拮抗剂预处理后，CaSR被抑制，Dvl-1和β-catenin表达也明显下降，与R组比较差异有统计学意义。这些结果可以初步说明，在大剂量瑞芬太尼致卵巢癌裸鼠心肌损伤过程中CaSR介导Dvl-1的激活，作为关键枢纽Dvl-1又激活了Wnt/βcatenin通路，从而启动了心肌损伤的发生过程。

综上所述，本研究结果表明持续大剂量输注瑞芬太尼通过激活CaSR介导Dvl-1表达激活Wnt/βcatenin信号途径诱导卵巢癌裸鼠心肌细胞损伤。