三七和PDTC对创伤性脑损伤大鼠自噬机制的干预作用

石莹 王灵聪 周霞庆 蒋慧芳

创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）因其高发病率、高致残率和高病死率，以及造成的社会经济负担，目前仍然是全球医疗界关注的热点问题之一[1-3]。近年来研究发现自噬在TBI中发挥了重要作用[4]，而NF-κB特异性抑制剂吡咯醛二硫氨基甲酸酯（pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC）对TBI后继发性脑损伤具有保护作用[5]，既往研究发现脑缺血大鼠存在自噬，处理脑缺血能促进脑组织微管相关蛋白轻链3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和自噬相关蛋白Beclin1表达上升，减轻脑缺血再灌注损伤[6]；传统中药三七能减轻TBI大鼠脑出血，明显改善神经功能缺陷评分[7]。笔者在上述研究基础上进一步探讨三七、PDTC对TBI大鼠脑组织自噬、神经功能恢复的作用，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雄性大鼠36只，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司 [生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]，体重（250±20）g；三七粉购自杭州华东中药饮片有限公司；PDTC（vn27735X）以及自噬抑制剂氯喹（50-63-5）购自美国Sigma公司。p62一抗（ab56416）、Beclin1一抗（ab207612）、LC3一抗（ab128025）购自英国Abcam公司。

1.2 仪器和设备 SpectraMax Plus 384型全波长酶标仪购自美国MD公司，电泳系统、凝胶成像仪购自美国Bio-RAD公司，H1650R型台式高速冷冻离心机购自湖南湘仪公司，TD5A型台式低速离心机购自湖南凯达公司，ZH-RXZ柔性颅骨转购自淮北正华公司，显微镜购自日本OLYMPUS公司（BX43），TECNAI10型透射电镜购自荷兰飞利浦公司。实验前所有仪器设备均校准。

1.3 方法

1.3.1 动物分组、模型制备及处理 按随机数字表法将大鼠分为假手术组（SHAM组）、模型组（M组）、三七组（PN组）、PDTC组（PDTC组）、三七联合 PDTC组（PN+PDTC组）、三七联合氯喹组（PN+CHQ组），每组6只。除SHAM组外，其余各组大鼠均行TBI模型制备：戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，采用改良的Feeney自由落体模型制备法，具体详见文献[7]。SHAM组大鼠进行上述手术及麻醉程序，但无脑组织冲击损伤过程。6组大鼠术前3 d、术后3 d予0.9%氯化钠注射液1 ml每天分2次灌胃（每次0.5 ml），术前 1 d、术后3 d予0.9%氯化钠注射液1 ml腹腔注射，1次/d。PN组灌胃时加入三七粉2.5 g/kg（既往实验筛选出最佳剂量[7]）。PDTC组腹腔注射时加入PDTC 120 mg/kg。PN+PDTC组灌胃时加入三七粉2.5 g/kg，腹腔注射时加入PDTC 120 mg/kg。PN+CHQ组灌胃时加入三七粉2.5 g/kg，腹腔注射时加入氯喹60 mg/kg。各组大鼠手术后第4天用戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉处死，取大鼠大脑组织进行检测。为避免人为误差，麻醉、手术、取材步骤分别由专人进行操作。

1.3.2 神经功能缺陷评分 造模后12、24、72 h由不清楚分组情况的3位观察者根据改良的7分法[8-9]独立进行神经功能缺陷评分，6分：提起鼠尾时双前肢能正常伸展；5分：提起鼠尾时双前肢能协调地偏向伤侧；4分：对于来自伤侧横向推动力的抵抗减弱；3分：提起及拉住鼠尾时能向瘫痪侧打圈；2分：拉住鼠尾时主动向瘫痪侧打圈；1分：主动向瘫痪侧打圈；0分：无自主活动。各组取平均分进行统计。

1.3.3 脑组织制作切片 各组大鼠脑组织在4%甲醛溶液中固定3～5 d；再经过不同浓度乙醇进行脱水处理；二甲苯透明处理；浸蜡包埋后切片，厚度4 μm；最后放入65℃恒温箱中烤片6～12 h。

1.3.4 HE染色以及Nissl染色 HE染色：脑组织染色后镜下观察，对各个样本做综合性病理描述。Nissl染色：脱蜡复水后切片浸入甲苯胺蓝溶液染色后水洗，冰醋酸分化后水洗，风干后二甲苯透明并封片，镜下选择损伤区或损伤区附近的神经元观察，对比各组神经元尼氏体变化。

1.3.5 脑组织透射电镜检查 取脑组织块，2.5%戊二醛（含1%锇酸）固定1 h；0.1 M PBS冲洗15 min×2次；2%醋酸铀水溶液染色30 min；50%、70%、90%乙醇依次脱水，各15 min×1次；100%乙醇脱水20 min×1次；100%丙酮脱水20 min×2次；无水丙酮与包埋剂按1∶1体积混合渗透组织，并震荡2 h；纯包埋剂渗透组织，并震荡2 h，并置于烘箱内聚合：37℃聚合24 h，45℃聚合24 h，60℃聚合48 h；修块后并超薄切片（约120 nm）；4%醋酸铀染色20 min，枸橼酸铅染色5 min；将染色后的超薄切片放到单孔铜网上，TECNAI 10透射电镜下观察并拍照。

1.3.6 Western blot检测脑组织p62、Beclin1和LC3水平 取组织蛋白样品，根据BCA法测定的蛋白浓度，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳：上样量为每泳道30 μg，电泳后的凝胶转PVDF膜，将PVDF膜浸入含5% BSA的封闭液中，室温封闭1 h。取出已封闭的PVDF膜，浸于1×TBST缓冲液中洗涤5 min。然后移入含有p62、Beclin1或LC3的一抗的孵育盒中，4℃孵育过夜。1×TBST缓冲液洗涤后。将PVDF膜转移到含二抗（Goat anti-Mouse IgG）的抗体孵育盒中，室温孵育2 h。TBST缓冲液洗涤后，把ECL试剂盒中等体积的A液和B液混合，混匀后加在膜的表面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。ChemiDoc系统采集发光图像，使用Image J软件计算鉴定条带的综合吸光度（IA），按下式计算各蛋白的表达情况：相对蛋白表达=IA（目的蛋白）/IA（内参蛋白）。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组大鼠造模前及造模后12、24、72 h神经功能缺陷评分的比较 6组大鼠造模前进行神经功能缺陷评分均为6分。造模后，SHAM组大鼠神经功能缺陷评分正常，其余各组大鼠造模后均出现不同程度的神经功能缺陷，表现为拉住鼠尾向对侧打圈，来自伤侧横向推动力的抵抗减弱等。与SHAM组比较，各组12、24、72 h神经功能缺陷评分均明显降低（均P＜0.01）。PN组、PDCT组、PN+PDCT组、PN+CHQ 组 12、24 h评分与M组比较差异均无统计学意义，72 h神经功能缺陷评分明显改善（P＜0.05或0.01）。PN组、PDCT组、PN+PDCT组、PN+CHQ组 12、24、72 h神经功能缺陷评分比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 6组大鼠造模前及造模后12、24、72h神经功能缺陷评分的比较（分）

2.2 6组大鼠大脑组织HE染色情况比较 SHAM组结构正常，未见病变。M组脑损伤一侧可见超过50%脑组织溶解缺损，残存组织可见出血、大量血管、纤维增生和大量炎细胞浸润，损伤区周围可见神经元固缩。PN组HE染色下可见病变同M组，损伤明显较M组小，约为30%。PDTC组，损伤范围约为20%，其余病变同M组。PN+PDTC组、PN+CHQ损伤范围均约为25%，其余病变同M组。见图1（插页）。

图1 6组大鼠大脑组织HE染色情况（SHAM组为假手术组；M组为模型组；PN组为三七组；PDTC组为NF-κB抑制剂吡咯醛二硫氨基甲酸酯组；PN+PDTC组为三七联合PDTC组；PN+CHQ组三七联合氯喹组；×200）

2.3 6组大鼠大脑组织Nissl染色情况比较 SHAM组尼氏体位于细胞核周围，清晰可见。M组样本损伤区附近大量神经元尼氏体明显减少，部分神经元仅可见裸露的细胞核，未见尼氏体。PN组、PDCT组、PN+PDCT组、PN+CHQ组损伤区或损伤区附近，少数神经元内可见尼氏体，相较M组，病变有所减轻。见图2（插页）。

图2 6组大鼠大脑组织Nissl染色情况（SHAM组为假手术组；M组为模型组；PN组为三七组；PDTC组为NF-κB抑制剂吡咯醛二硫氨基甲酸酯组；PN+PDTC组为三七联合PDTC组；PN+CHQ组三七联合氯喹组；×200）

2.4 6组大鼠大脑组织透射电镜情况比较 SHAM组可见神经元形态正常，细胞质基质和细胞器分布均匀，未见病变。M组可见细胞核内染色质固缩，细胞质分布不均匀或空泡化，多数细胞器空泡、基质溶解消失，细胞质中可见大量自噬体，是所有样本中自噬最多的组别。PN组、PDCT组、PN+PDCT组、PN+CHQ组细胞质内均可见大量自噬体，但较M组少；局部细胞质空泡化，但仍可见正常的细胞器，相对M组有所减轻。见图3。

图3 6组大鼠大脑组织透射电镜情况（SHAM组为假手术组；M组为模型组；PN组为三七组；PDTC组为NF-κB抑制剂吡咯醛二硫氨基甲酸酯组；PN+PDTC组为三七联合PDTC组；PN+CHQ组为三七联合氯喹组；×10 000）

2.5 6组大鼠大脑组织中p62、Beclin1和LC3表达的比较 各组大鼠造模3 d后取大脑组织测定p62、Beclin1和LC3表达，M组比SHAM组明显增加（P＜0.05或0.01）。PN组、PDCT组、PN+PDCT组、PN+CHQ 组p62、Beclin1和LC3表达较M组明显下降（P＜0.05或0.01）。PN组、PDCT组、PN+PDCT组、PN+CHQ组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2和图4。

图4 6组大鼠脑组织p62、Beclin1和LC3表达（SHAM组为假手术组；M组为模型组；PN组为三七组；PDTC组为NF-κB抑制剂吡咯醛二硫氨基甲酸酯组；PN+PDTC组为三七联合PDTC组；PN+CHQ组三七联合氯喹组）

表2 6组大鼠大脑组织中p62、Beclin1和LC3表达的比较

3 讨论

本实验研究了TBI大鼠自噬发生情况以及三七、PDTC药物干预后的变化，结果发现，大鼠脑部创伤发生后存在自噬并伴有脑功能损伤，表现为神经功能缺陷评分明显下降，HE染色和Nissl染色脑组织损伤明显，透射电镜下脑细胞中可见大量自噬体，自噬蛋白明显升高。既往研究中发现三七以及PDTC对TBI大鼠脑组织有保护作用[5，7]，在本研究中，三七以及PDTC均能改善TBI大鼠神经功能缺陷评分，同时HE染色和Nissl染色脑组织损伤较M组改善，透射电镜下脑细胞中可见自噬体较M组减少，自噬蛋白下降，说明三七以及PDTC均能干预TBI大鼠自噬过程，促进脑功能恢复。对比三七以及PDTC两组，PDTC在HE染色中，脑组织损伤范围较PN组略有优势，其余差异均无统计学意义。三七联合PDTC以及三七联合氯喹在上述各观测指标上与PN组和PDTC组差异均无统计学意义，说明三七与PDTC以及三七与氯喹并无明显协同作用。

三七为五加科植物三七的干燥根，传统中医认为三七不仅能止血，又能活血散瘀，有“止血而不留瘀，化瘀而不伤正”的特点，被誉为“血证良药”。笔者团队临床观察中发现三七粉对颅脑损伤患者深静脉血栓形成（deep venous thrombosis,DVT）的防治有一定效果，14 d后D二聚体水平以及静脉栓塞发生率三七组明显低于对照组，PT、APTT、PLT改变不明显[10]。既往研究也发现三七治疗脑出血合并DVT大鼠，出血量、血肿程度和梗死面积明显少或减轻，结扎血管栓塞明显好转，而且能一定程度上双向调节血小板活化因子CD62P的表达[11]，且高浓度三七对预防和治疗大鼠静脉血栓栓塞均有效[12]。因此三七或许是高危静脉栓塞合并出血风险最有潜力的防治药物。本研究在前期基础上对三七干预TBI大鼠自噬进行了进一步探讨，对于完善三七作用机制研究具有十分重要的意义。NF-κB是细胞内重要的核转录因子，它参与机体的炎症反应、免疫应答，能调节细胞凋亡、应激反应，与自噬相互调节[13]。本研究中PDTC作为NF-κB的特异性抑制剂，能干预TBI大鼠自噬过程，促进脑功能恢复，但三七与PDTC无明显协同作用。同样，三七与氯喹亦未见明显协同作用，这对今后临床用药选择提供有效的借鉴。

近年来越来越多的研究发现TBI自噬是十分复杂的过程，它对于TBI起保护性作用还是损害性作用，TBI后自噬是增强还是减弱，没有定论，仍需深入研究[14]。本研究发现造模3d大鼠脑细胞中可见大量自噬体，自噬蛋白明显升高，但对TBI后自噬情况亦无法定论，这也是本研究的不足之处。今后研究中将进一步细化，定量自噬流变化，同时增加观测时间点，以期更明确相关机制，从而更有效地服务临床。