三七皂苷R1对氧化型低密度脂蛋白诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用

孟伟阳 李永领 闻浩 潘达 陈健 金灿 叶孙志 陈大庆

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）的特征是血管内皮细胞内脂质斑块堆积[1]。血管内皮损伤是AS的始发事件和致病因素，主要由氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL）引起[2]。ox-LDL破坏血管内皮细胞氧化还原平衡，导致内皮损伤，从而诱导内皮细胞凋亡[3]。氧化应激通过增加超氧阴离子促进血管壁的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein,LDL）氧化，而大量的ox-LDL进一步损害血管内皮细胞[4]。内皮细胞因损伤发生凋亡是AS发展过程中最初但可逆的步骤[5]。因此，预防内皮损伤及细胞凋亡已成为逆转AS的一种治疗策略。研究表明，传统中药三七对血液和心血管系统具有良好的调节作用[6-7]。三七皂苷 R1（notoginsenoside R1,NGR1）是三七中起主要生物学作用的成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用[8-9]。然而，目前关于NGR1是否可以预防ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡以及增强内皮细胞的黏附和迁移能力尚未明确。本研究通过ox-LDL建立AS的体外细胞实验模型，诱导血管内皮细胞凋亡，并且探讨NGR1对ox-LDL损伤的血管内皮细胞保护作用及其机制，为NGR1防治心血管疾病提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞系（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs,h055）购于南京 BERKE biology公司。钙黄绿色（Calcein AM,C2012）购于上海Beyotime公司。NGR1（HY-N0615）购于美国 MedChem-Express公司。结晶紫（HT90132）、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO,D2650）购于美国Sigma公司。CCK-8（CK04）购于日本DOJINDO公司。Transwell小室（3422）购于美国康宁公司。兔抗人B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2，#3498）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bax，#14796）多克隆抗体和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，#4083）购于美国CST公司。兔抗人Cleaved-caspase-3（ab49822）多克隆抗体以及Dylight 594驴抗兔二抗（ab96921）均购于美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、处理以及分组 HUVECs使用高糖完全培养基（含10%FBS以及100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素）培养，待细胞密度长至80%～90% 时，用PBS将细胞培养液清洗干净后，加入含0.02%EDTA的胰酶消化细胞。待细胞全部脱壁漂浮后，加入3倍体积的完全培养基中和胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，用完全培养基重悬HUVECs，将细胞浓度调整为1×104个/ml的细胞悬液待用。将NGR1粉剂（10 mg）溶于 DMSO（357.2 μl）中，配成 30 mmol/L 的母液保存于-20℃冰箱待用。将体外培养HUVECs分为对照组、损伤组（ox-LDL组）和4种浓度NGR1治疗组（ox-LDL+不同浓度NGR1组）。

1.2.2 NGR1药物毒性及其对HUVECs增殖活性影响检测 将上述细胞悬液接种于96孔板中（100 μl/孔）。将培养板放在37℃、5% CO2条件下的恒温培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁后，分别将不同浓度的NGR1（7.5、15、30、60 μmol/L）溶液加入对应的 96 孔板中，再放入细胞培养箱预处理48 h。用于药物毒性测试的细胞，将每孔中的药物洗净后，加入10 μl CCK-8溶液；用于增殖活性检测的细胞将每孔中的药物洗净后，加入ox-LDL 50 mg/L刺激24 h，再加入10 μl CCK-8溶液。空白组为 100 μl PBS，再加入 10 μl CCK-8溶液。将加入CCK-8溶液的培养板移入培养箱中避光孵育1 h，随后取出培养板，用全自动酶标仪测定每孔的吸光度，测定波长为 450 nm，并计算细胞增殖活性，细胞增殖活性=[（实验组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）]×100%。每个样品每次含有3个复孔，实验重复3次。

1.2.3 细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3）表达检测 采用Western blot法。各组HUVECs用RIPA裂解液裂解后，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度并配平每组蛋白的上样量。配制蛋白样品时保证20 μl样品中含30 μg蛋白；12% SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后，用5%脱脂牛奶常温封闭2 h。随后将PVDF膜放入相应的抗体孵育盒中（Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3 抗体按1∶1 000的比例稀释），在4℃摇床上孵育过夜；一抗孵育结束之后，将PVDF膜用TBST漂洗3次，5 min/次，再将PVDF膜转入HRP结合的二抗孵育盒，放于摇床上，室温孵育2 h后再用TBST漂洗3次，5 min/次；二抗孵育结束之后，将ECL显色液均匀敷在膜上，在凝胶成像仪上曝光成像，并用Image J软件分析计算各组蛋白条带的灰度值。

1.2.4 细胞凋亡检测 采用免疫荧光法。将上述细胞悬液接种于24孔板中（500 μl/孔）。待细胞完全贴壁后，向各孔中分别加入15、30 μmol/L NGR1预处理48 h，然后再用ox-LDL 50mg/L刺激24 h。随后用4%多聚甲醛固定HUVECs 15 min，0.1% Triton通透15 min，5%山羊血清封闭 2 h，最后将Cleaved-caspase-3一抗（1∶200）稀释，加入到各个孔中，4℃冰箱孵育过夜。第2天取出24孔板，37℃复温1 h后，吸净一抗，并用PBS清洗3次，5 min/次，随后加入驴抗兔Dylight 594二抗（1∶300稀释），37℃孵育 1 h后，吸净二抗，并用PBS清洗3次，5 min/次，最后加入DAPI染核 5 min，应用抗荧光淬灭剂封固。在荧光显微镜下观察染色的细胞（即凋亡细胞），通过Image J软件分析并计算各组不同视野下的Cleaved-caspase-3的平均荧光强度。

1.2.5 细胞黏附能力检测 采用钙黄绿素细胞膜标记染色。将 HUVECs经 15、30 μmol/L NGR1预处理 48 h及ox-LDL 50mg/L刺激24 h后，用胰酶消化并用完培重悬每组细胞。随后每组细胞悬液中加入钙黄绿素染色工作液，37℃孵育30 min。孵育结束后，1 000 r/min离心5 min，吸除上清液，缓慢加入37℃预热的培养基重悬细胞。再次以1 000 r/min离心5min，以充分去除残留的染色液。最后将钙黄绿素标记的HUVECs接种于预包被人纤维连接蛋白1 μg/ml的培养板中，37℃孵育30 min，然后用PBS清洗3次，5 min/次，将未贴壁的HUVECs洗净。在倒置荧光显微镜下观察并计数5个随机视野。

1.2.6 细胞迁移能力检测 采用Transwell迁移试验。将HUVECs经 15、30 μmol/L NGR1 预处理 48 h 及 ox-LDL 50mg/L刺激24 h后，用胰酶消化并用无血清的高糖DMEM培养基重悬每组细胞，将200 μl的细胞悬液置于孔径为8 μm的Transwell小室上部。最后将高糖DMEM 培养基（700 μl，含 2% FBS）加入小室的下部。将Transwell板在37℃下培养48 h。弃去培养基，用湿棉签擦拭每个Transwell小室膜的上层部分以除去未迁移细胞。迁移细胞用4%多聚甲醛固定，并用0.2%结晶紫染色。从6个随机选择的显微镜视野计数平均迁移细胞数。

1.3 统计学处理 采用Graphpad Prism 5.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度NGR1作用后HUVECs增殖活性的比较 与对照组相比，NGR1治疗组HUVECs的增殖活性逐渐提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；HUVECs的增殖活性随着NGR1浓度的增加而增加，在30 μmol/L时达到高峰，随后增加NGR1浓度至60 μmol/L时，HUVECs的增殖活性反而出现少许下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表1 不同浓度NGR1作用后HUVECs增殖活性的比较

2.2 不同浓度NGR1作用后ox-LDL诱导HUVECs增殖活性的比较 与对照组相比，损伤组的细胞增殖活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与损伤组相比，NGR1治疗组细胞增殖活性显著增加，在NGR1治疗浓度为30 μmol/L时，其抗ox-LDL所诱导的凋亡效果达到峰值，差异有统计学意义（P＜0.05）；随后继续增加浓度至60 μmol/L时，NGR1治疗组HUVECs细胞的增殖活性反而有所下降，说明高浓度NGR1存在一定的细胞毒性。NGR1发挥抗凋亡活性以30 μmol/L为最适宜浓度，所以选取15和30 μmol/L NGR1的治疗浓度用于后续实验，见表2。

表2 不同浓度NGR1作用后ox-LDL诱导HUVECs增殖活性的比较

2.3 各组细胞凋亡相关蛋白表达的比较 与对照组比较，损伤组凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-caspase-3的表达明显上升（P＜0.05），而Bcl-2蛋白表达明显下降（均P＜0.05）；而与损伤组比较，NGR1治疗组中 Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达显著下降（均P＜0.05），而Bcl-2蛋白表达明显上升（P＜0.05），且凋亡相关蛋白皆呈浓度依赖性，见图1和表3。

图1 各组细胞凋亡相关蛋白的电泳图（NGR1为三七皂苷R1；ox-LDL为氧化型低密度脂蛋白；Bcl-2为兔抗人B淋巴细胞瘤-2蛋白；Bax为Bcl-2相关X蛋白）

表3 各组细胞凋亡相关蛋白表达的比较

2.4 各组细胞凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3表达的比较 与对照组比较，损伤组HUVECs内凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3表达增强，而在NGR1治疗组中，这种情况得到明显改善，凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3表达显著减弱，见图2（插页）和表4。

表4 各组细胞凋亡蛋白Cleaved-caspase-3表达情况的比较

图2 各组凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3染色图（NGR1为三七皂苷R1；ox-LDL为氧化型低密度脂蛋白；免疫荧光，×40）

2.5 各组细胞黏附能力的比较 与对照组比较，损伤组HUVECs的细胞黏附能力显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与损伤组比较，NGR1治疗组HUVECs的细胞黏附能力显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；黏附细胞个数随着NGR1浓度的增加而增大，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3（插页）和表 5。

图3 各组细胞黏附能力检测结果（NGR1为三七皂苷R1；ox-LDL为氧化型低密度脂蛋白；钙黄绿素染色，×10）

表5 各组细胞黏附细胞数的比较

2.6 各组细胞迁移能力的比较 与对照组比较，损伤组HUVECs的细胞迁移能力显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与损伤组比较，NGR1治疗组HUVECs的细胞迁移能力显著提高，差异有统计学意义（P＜0.05）；迁移细胞数随着NGR1浓度的增加而增大，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 4（插页）和表6。

图4 各组细胞迁移能力检测结果（NGR1为三七皂苷R1；ox-LDL为氧化型低密度脂蛋白；结晶紫染色，×20）

表6 各组细胞迁移细胞数的比较

3 讨论

AS的发展是一个相对较复杂的过程[5]，目前，AS确切的发病机制仍不清楚。许多研究表明，ox-LDL通过激活活性氧自由基（ROS）和丙二醛（MDA）诱导氧化应激，通过释放炎性细胞因子刺激炎症，进而导致内皮细胞损伤，最终引起内皮细胞的凋亡[10-11]。研究显示，Bcl-2家族和caspase家族在细胞凋亡转导通路尤其是线粒体途径中发挥了极为重要的调控作用。Bcl-2、Bax蛋白位于线粒体上游，是线粒体膜的通透性改变的重要调控因素，其过度表达能控制其下游caspase-3蛋白酶的活化，介导细胞的存活或死亡[12]。因此caspase-3被认为是细胞凋亡发病机制中的关键酶。当全长caspase-3（32kD）被激活时，它被切割形成两个成熟亚基：p17（17kD）和 p12（12kD）；进而 Cleaved-caspase-3水平代表活化的caspase-3水平[13-14]。所以，检测内皮细胞的凋亡水平是衡量ox-LDL对细胞影响的有效方法。本研究发现ox-LDL可以显著诱导HUVECs凋亡，而NGR1的干预可以明显缓解其凋亡的发生，并且可以改善内皮细胞的黏附和迁移能力。

三七是五加科植物的一员，作为传统中药已有数千年的历史，特别是根茎常被临床用来维持人体微环境稳态，并用于治疗心血管系统、神经系统以及代谢相关疾病[15-17]。其中NGR1是三七中发挥最主要药理学效益的生物活性物质[16]。近年来，越来越多的证据表明，NGR1具有多种生物活性，包括心血管保护[8]、神经保护[18]和抗肿瘤[19]。本研究选取人正常内皮细胞HUVECs为实验材料，通过ox-LDL诱导建立内皮细胞凋亡模型，通过CCK-8检测初步探讨NGR1是否具有拮抗由ox-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡的功能。本研究结果表明，NGR1可以发挥抗凋亡的作用，保护内皮细胞，增加其细胞增殖活性，减少caspase-3的激活。为了探索存活下的内皮细胞功能是否完整，本研究进行了细胞迁移和细胞黏附实验，结果显示HUVECs用NGR1治疗后，显著改善了由ox-LDL造成的内皮细胞功能的减退，提高了HUVECs的黏附和迁移能力。

本研究采用ox-LDL诱导的HUVECs内皮细胞凋亡模型来观察NGR1的抗凋亡作用。结果表明，NGR1通过抑制ox-LDL诱导的HUVECs增殖活性降低、细胞凋亡增多、caspase-3蛋白的表达上调，细胞迁移和黏附减少，从而发挥其对ox-LDL损伤的血管内皮细胞的保护作用。因缺乏体内实验的验证，本研究的结果具有一定的局限性，但为NGR1的进一步开发提供了一定的理论基础。