甲基转移酶样蛋白14介导长链非编码RNA EIF3J反义RNA1对胆管癌细胞迁移和侵袭的影响

欧阳柳 郑浩 程文英 陶元平 李慧芬 李小玲 张雷 李勃 郭世伟 胡先贵 金钢

1海军军医大学第一附属医院普外三科，上海 200433；2海军军医大学第三附属医院肝外三科，上海 200433；392493部队医院内三科，葫芦岛 125003；4海军军医大学第三附属医院介入科，上海 200433；592493部队医院门诊部，葫芦岛 125003

胆管癌根据胆管的解剖位置可分为肝内胆管癌和肝外胆管癌，通常确诊晚，常伴有肿瘤血管侵犯和淋巴结转移，导致预后较差[1-3]，患者的5年生存率只有20%～30%[4]。目前为止，胆管癌发生和进展的确切分子机制尚不完全清楚。RNA表观遗传修饰是RNA调节基因表达的化学基础，N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物信使RNA(messenger RNA, mRNA)中含量最丰富的转录后修饰之一，约占总修饰的50%[5]，其修饰的生成依赖于甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase-like protein 14，METTL14)。METTL14是m6A甲基化修饰酶的重要编码器，在多种肿瘤的发生和进展中发挥重要作用[6]。研究表明，长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡调控中也起着关键作用[7-10]。lncRNA EIF3J反义RNA1(antisense RNA1，EIF3J-AS1)首次报道在肝细胞癌肿瘤样本中显著上调[11]，并且其表达异常与食管癌和结肠癌等的发生与进展密切相关[12-13]。通过在线数据库GEPIA(http://gepia.cancerpku.cn/)证实METTL14与lncRNA EIF3J-AS1(lnc EIF3J-AS1)在胆管肿瘤组织中表达呈正相关，但METTL14是否直接介导lnc EIF3J-AS1在胆管癌肿瘤中异常表达，从而促进胆管癌的发生仍尚未完全明确。本研究拟探讨METTL14介导lnc EIF3J-AS1促进胆管癌进展的潜在分子机制。

材料与方法

一、胆管癌组织METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表达检测

收集2017年9月至2018年12月间海军军医大学第一附属医院普外三科行手术切除并经病理学证实的10例原发性胆管癌患者的癌组织和对应的癌旁正常组织(距离肿瘤组织边缘>2 cm)，其中男性9例，女性1例，年龄(52±8)岁。所有样本离体后即刻置液氮冷冻，于-80℃冰箱保存。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

应用Trizol法抽提胆管癌组织及癌旁组织总RNA,采用RNA逆转录与扩增试剂盒(日本TaKaRa公司)转录cDNA，再用GreenTMTB Premix Ex TaqTM(T1iRnaseH P1us，日本TaKaRa公司)行实时荧光定量PCR反应，按试剂盒说明书操作，以GAPDH为内参。METTL14正向引物序列为5′-ACTTGCTGGGTACAAGTA-3′，反向引物序列为5′-CCTTCTGATGCTTGTCTGTT-3′；lnc EIF3J-AS1正向引物序列为5′-GTCAGATTTTGTCCGTTCA-3′，反向引物序列为5′-CATGGACTTGACGTAGCTGTT-3′；内参GAPDH正向引物序列为5′-GGAGTTACTTCTATGCCTGA-3′，反向引物序列为5′-TTCATGGGGAGGTACAAC-3′。反应条件：95℃预变性10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共40个循环。通过仪器自带软件获取Ct值，应用 2-△△CT公式计算METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1的相对表达量，每个样品设3个复管，取均值。

二、胆管癌组织METTL14蛋白表达检测

采用人蛋白裂解液(美国Roche公司)裂解胆管癌组织及癌旁组织，抽提总蛋白，应用BCA法定量后常规行蛋白质免疫印迹法检测METTL14蛋白表达，以actin为内参。抗METTL14抗体(1∶1 000)购自英国Abcam公司(ab220030)，HRP二抗(1∶3 000)购自武汉博士德生物科技有限公司。最后ECL发光， X片曝光、显影、定影。用Image J软件扫描，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

三、胆管癌HUCCT1和RBE细胞METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表达检测

胆管癌细胞株HUCCT1和RBE均取自中国上海科学院细胞库，常规复苏及培养传代。取对数生长期细胞接种于96孔板，分为HUCCT1对照组和HUCCT-METTL14组，RBE对照组和RBE-METTL14组。两对照组分别转染相应的阴性对照的慢病毒，两METTL14组分别转染相应的干扰METTL14表达的慢病毒。所有慢病毒均购自上海吉玛生物制药有限公司。慢病毒转染按慢病毒转染试剂盒说明书操作，并筛选出稳定转染的细胞株。取上述4组稳定转染的对数生长期细胞，按前述的实时荧光定量PCR检测各组细胞METTL14 mRNA和lnc EIF3J-AS1表达量。

四、胆管癌HUCCT1和RBE细胞迁移和侵袭能力检测

同上法将胆管癌细胞株分为HUCCT1对照组和HUCCT1-lnc EIF3J-AS1组，RBE对照组和RBE-lnc EIF3J-AS1组。两对照组分别转染相应的阴性对照慢病毒，两lnc EIF3J-AS1组分别转染相应的干扰lnc EIF3J-AS1表达的慢病毒。应用Transwell小室(美国Corning公司)实验检测细胞迁移能力。将Transwell小室隔膜上面用凝胶覆盖后检测细胞侵袭能力。将含1×105个细胞的100 μl无血清培养液加入Transwell小室的上室，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液500 μl，培养24 h后取出小室隔膜，用棉签轻轻擦去隔膜上面未穿膜的细胞，用4%多聚甲醛室温固定隔膜30 min，PBS洗3次，1.5%亚甲蓝染色，室温干燥，在显微镜下观察5个高倍镜视野，计算每个视野的穿膜细胞数，取均值。

五、胆管癌HUCCT1和RBE细胞EGFR和AKT蛋白表达检测

收集HUCCT1对照组、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1组、RBE对照组、RBE-lnc EIF3J-AS1组对数生长期细胞，裂解提取细胞总蛋白，按前述的蛋白质免疫印迹法检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达，以actin为内参。抗EGFR抗体(1∶1 000，ab52894)、p-AKT 抗体(1∶2 000，ab38449)、AKT抗体(1∶2 000，ab8805)均购自英国Abcam公司，HRP二抗(1∶3 000)购自武汉博士德生物科技有限公司。p-AKT、AKT蛋白表达以两者的比值表示。

六、统计学处理

结 果

一、胆管癌组织和癌旁组织METTL14、lnc EIF3J-AS1表达水平及其相关性

胆管癌组织及其癌旁正常组织METTL14 mRNA表达量分别为0.075±0.012和0.031±0.006，lnc EIF3J-AS1表达量分别为0.140±0.032和0.064±0.012，癌组织表达量均显著高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义(t值分别为9.85、10.79，P值均<0.05)。胆管癌组织METTL14 mRNA与lnc EIF3J-AS1表达水平呈正相关(r=0.883，P=0.0007，图1)。

图1 10例胆管癌组织METTL14 mRNA与lnc EIF3J-AS1表达的相关性

胆管癌组织及其癌旁正常组织METTL14蛋白表达量分别为0.354±0.131和0.187±0.183，癌组织显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(t=13.51，P=0.008，图2)。

图2 10例胆管癌组织和癌旁正常组织METTL14蛋白表达水平

二、抑制胆管癌细胞METTL14 mRNA表达对lnc EIF3J-AS1表达的影响

HUCCT1-METTL14组细胞METTL14 mRNA表达水平显著低于对照组(0.109±0.023比1.000±0.035)，RBE-METTL14组METTL14 mRNA表达水平也显著低于对照组(0.137±0.011比1.000±0.019 )，差异均有统计学意义(t值分别为8.91、12.51，P值均<0.05)。表明敲减METTL14的HUCCT1和RBE细胞株构建成功。

HUCCT1-METTL14组细胞lnc EIF3J-AS1表达水平显著低于对照组(0.217±0.020比1.000±0.052)，RBE-METTL14组lnc EIF3J-AS1表达水平也显著低于对照组(0.149±0.066比1.000±0.045)，差异均有统计学意义(t值分别为8.02、11.23，P值均<0.05)。提示抑制胆管癌细胞METTL14表达可下调lnc EIF3J-AS1的表达。

三、下调lnc EIF3J-AS1表达对胆管癌细胞迁移和侵袭能力的影响

HUCCT1-lnc EIF3J-AS1组细胞lnc EIF3J-AS1表达水平显著低于对照组(0.123±0.045比1.000±0.011)，RBE-lnc EIF3J-AS1组lnc EIF3J-AS1表达水平也显著低于对照组(0.108±0.059比1.000±0.029)，差异均有统计学意义(t值分别为10.22、11.21，P值均<0.05)。表明敲减lnc EIF3J-AS1的HUCCT1和RBE细胞株构建成功。

细胞迁移实验结果显示，HUCCT1-lnc EIF3J-AS1组细胞的迁移和侵袭能力均较对照组显著下降(每高倍视野穿膜细胞数20.33±0.67比70.67±0.33，5.00±0.58比23.33±0.33)，差异均有统计学意义(t值分别为12.23、11.59，P值均<0.05，图3)；RBE-lnc EIF3J-AS1组细胞迁移和侵袭能力也均较对照组显著下降(每高倍视野穿膜细胞数12.00±0.58比25.00±2.52，22.33±0.89比43.67±0.33)，差异均有统计学意义(t值分别为15.12、8.66，P值均<0.05，图3)。提示下调胆管癌细胞lnc EIF3J-AS1表达可抑制其迁移和侵袭能力。

四、下调lnc EIF3J-AS1表达对胆管癌细胞EGFR-AKT信号通路的影响

HUCCT1-lnc EIF3J-AS1组EGFR蛋白表达水平和p-AKT/AKT比值均较对照组显著降低(0.109±0.015比1.000±0.018，0.226±0.036比1.000±0.051，图4)，差异均有统计学意义(t值分别为8.56、12.77，P值均<0.05)。RBE-lnc EIF3J-AS1组EGFR蛋白表达水平和p-AKT/AKT比值也均较对照组显著降低(0.118±0.052比1.000±0.069，0.132±0.098比1.000±0.023，图4)，差异均有统计学意义(t值分别为10.81、12.21，P值均<0.05)。提示下调胆管癌细胞lnc EIF3J-AS1可抑制其EGFR蛋白表达，抑制AKT蛋白的磷酸化。

图3 HUCCT1对照组、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1组、RBE对照组、RBE-lnc EIF3J-AS1组的迁移(3A～3D)和侵袭(3E～3H)能力(亚甲蓝染色 ×400)

图4 HUCCT1对照组(1)、HUCCT1-lnc EIF3J-AS1组(2)、RBE对照组(3)、RBE-lnc EIF3J-AS1组(4)胆管癌细胞EGFR、p-AKT、AKT蛋白表达

讨 论

m6A修饰是真核RNA中最常见的化学标记，是一种可逆的表观调控修饰[14]。这种修饰被发现于嵌入RNA转录产物共识序列G(G>A)m6AC(U>A>C)中的腺苷，特别是在终止密码子附近[15]。越来越多的证据表明，RNA中的m6A修饰影响RNA的稳定性和功能，并对大多数生物过程至关重要，包括组织发育、DNA损伤反应、性别决定和肿瘤发生等[16]。m6A甲基转移酶复合物由METTL3、METTL4、METTL14、WTAP、VIRMA等组成[17]。近期研究表明，甲基化转移酶METTL4在多种实体恶性肿瘤的发生及进展中发挥着重要作用，然而METTL14在胆管癌的发生和进展中的作用在很大程度上尚不清楚[18]。本研究通过定量PCR以及蛋白免疫印迹实验证实m6A甲基化酶METTL14在胆管癌肿瘤组织中上调表达，提示METTL14可能在胆管癌的发生和进展中扮演重要的癌基因角色。

lnc RNA在胆管癌的发生发展中扮演关键角色，其中lnc EIF3J-AS1首次报道在肝细胞癌肿瘤样本中显著上调，并与肝细胞癌的无复发生存密切相关[11]。然而，其对胆管癌细胞恶性行为的潜在生物学作用尚未见报道，且是否受到m6A调控尚未明确。本研究证实lnc EIF3J-AS1在胆管癌肿瘤组织中表达上调，并且与METTL14呈正相关，抑制METTL14表达可下调lnc EIF3J-AS1在胆管癌细胞中的表达水平。进一步实验证实下调lnc EIF3J-AS1可抑制胆管癌细胞迁移和侵袭能力，并抑制EGFR蛋白表达和Akt蛋白的磷酸化，提示METTL14可能通过上调lnc EIF3J-AS1表达在胆管癌细胞恶性行为中和EGFR-Akt信号通路调控中发挥重要作用。

综上所述， m6A甲基化酶METTL14介导lnc EIF3J-AS1上调表达可以促进胆管癌细胞的侵袭和迁移能力，但本研究的队列样本量少，未来仍需扩大样本量进一步验证METTL14与lnc EIF3J-AS1在胆管癌组织和细胞中的表达情况，以及与胆管癌患者预后之间的关系。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突