酪酸梭菌及丁酸盐对急性坏死性胰腺炎合并肝损伤大鼠的作用及机制研究

严清青 贾林 何梓健 黄耀星 李伟冬

1广州市第一人民医院(华南理工大学附属第二医院)消化内科，广州 510180；2广州市番禺中心医院消化内科，广州 511400

AP是临床上常见的急腹症之一，发病机制复杂，病情进展迅速[1]，特别是进展到SAP阶段，体内大量炎症递质释放，可诱发多个胰外器官的损伤[2]。肝脏是SAP患者较早发生损伤的胰外器官[3]。SAP发生后机体迅速出现超高代谢、内环境紊乱、免疫功能降低、营养不良及继发感染，同时合并菌血症、感染性坏死、器官功能衰竭等，这些均与肠屏障功能障碍息息相关。研究已证实，肠道菌群紊乱与SAP患者的肠屏障功能障碍和高死亡率有关，同时与多种肝脏疾病的发生、发展及转归密切相关[4]。因此，维护肠功能和调节肠道菌群对改善SAP患者的预后极为重要，早期肠内营养支持和给予益生菌治疗为常用手段。研究指出，酪酸梭菌(C.butyricum，CB)及其代谢产物丁酸盐(sodium butyrate，SB)通过减少炎症因子的释放调节肠道微生态并维持肠屏障功能的稳定[5]。本研究构建ANP大鼠模型，观察酪酸梭菌或丁酸盐干预对ANP大鼠胰腺、肝脏及肠黏膜变化的影响，探讨其发生机制。

材料与方法

一、实验动物及分组

40只SPF级Sprague-Dawley雌性大鼠由南方医科大学动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2016-0041。使用随机数字表法将大鼠分成正常对照组、ANP组、酪酸梭菌干预组(CB组)、丁酸钠干预组(SB组)，每组10只。采用经胰胆管注射4.5%牛黄胆酸钠溶液1 mg/kg的方法构建ANP模型。CB组大鼠于造模前10 d给予酪酸梭菌1×109CFU/ml灌胃，每天1次；SD组大鼠于造模前10 d给予丁酸钠100 mg·kg-1·d-1灌胃；对照组、ANP组灌入等容积生理盐水。制模后24 h采用左下腹直接穿刺并连接压力换能器测定大鼠腹腔内压[6]。然后对大鼠进行麻醉、剖腹，观察腹腔内各脏器大体情况，吸取腹水并计量。于腹主动脉取血，取末端回肠组织10 cm，取出肝脏及胰腺组织。各组织部分即置冻存液氮罐冷冻，部分置10%甲醛中固定。

二、方法

1．血清生物化学指标检测：取各组血标本，以3 000 r/min离心10 min，收集血清，应用全自动生物化学分析仪(奥林巴斯AU5400，日本)检测血淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT、TBil水平。采用ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-6、高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1 protein, HMGB1)水平，试剂盒购自英国abcam公司，严格按说明书操作。

2．肠屏障紧密连接蛋白表达检测：取冻存的各组大鼠回肠组织，加入蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，12 000 g离心15 min，吸取蛋白上清液，用BCA定量试剂盒确定上样浓度。采用常规蛋白质免疫印迹法检测紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1、occludin表达。抗兔ZO-1、claudin-1、occludin一抗购自英国abcam公司，工作浓度分别为1∶1 000、1∶800、1∶1 000；抗兔二抗购自碧云天公司，工作浓度为1∶2 000，转移至暗室显影，根据ECL化学发光检测试剂盒说明书混合发光液，并按步骤进行显影，反应底物浓度，随后采用Image J分析各蛋白表达量。

3．胰腺、肝脏组织病理学检查：取甲醛固定的各组大鼠胰腺和肝脏组织，常规脱水、石蜡包埋、连续切片、苏木精-伊红(HE)染色。由两位病理科医师盲法在光镜下观察组织的病理学改变，并参照改良Schmidt评价标准[7-8]进行胰腺组织病理评分，肝脏病理评估指标按照Camago等[9]提出的肝脏病理分级内容进行评分。

三、统计学处理

结 果

一、各组大鼠腹腔内压力变化及腹水量比较

ANP组大鼠腹腔内压力和腹水量均较对照组明显增加。CB组、SB组大鼠腹腔内压力和腹水量均较ANP组明显减少，但仍高于对照组，差异均有统计学意义，而CB组和SB组间的差异无统计学意义(表1)。

表1 各组大鼠腹腔内压力和腹水量变化

二、各组大鼠血生物化学指标的变化

ANP组大鼠的血淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT、TBil水平均较对照组明显增高，提示胰腺及肝脏损伤明显；ANP组血TNF-α、IL-6、HMGB1含量也明显高于对照组，差异均有统计学意义。CB组和SB组大鼠各项生物化学指标均较ANP组明显下降，差异也均有统计学意义，而CB组和SB组间的差异无统计学意义(表2)。

三、各组大鼠胰腺、肝脏组织病理学改变

对照组大鼠胰腺组织结构完整，未见组织水肿、腺泡坏死、白细胞浸润；ANP组大鼠胰腺组织水肿、腺小叶结构紊乱，有大片出血坏死和脂肪坏死，大量白细胞浸润；CB组和SB组大鼠胰腺组织水肿程度减轻，出血坏死范围较ANP组缩小，少量白细胞浸润(图1)。对照组、ANP组、CB组、SB组大鼠胰腺组织病理评分分别为1.18±0.05、11.20±1.08、9.45±1.06、9.04±0.89，ANP组显著高于其他3组，CB组和SB组高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而CB组与SB组间的差异无统计学意义(P>0.05)。

对照组大鼠肝脏组织未见肝血窦充血和水肿，未见炎性细胞和肝细胞气球样变，无出血和点状坏死或片状坏死；ANP组大鼠肝脏组织可见肝血窦充血水肿，大量炎性细胞浸润、肝细胞气球样变化，偶可见点状坏死；CB组和SB组大鼠肝脏组织肝血窦充血水肿程度较ANP组明显减轻，炎性细胞浸润减少，偶可见肝细胞气球样变，未发现出血和点状坏死(图2)。对照组、ANP组、CB组、SB组大鼠肝脏组织病理评分分别为0.56±0.09、2.89±0.73、2.09±0.49、2.12±0.52，ANP组高于其他3组，CB组和SB组高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而CB组与SB组间的差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠血生物化学指标的变化

四、各组大鼠肠黏膜紧密连接蛋白表达水平比较

对照组、ANP组、CB组、SB组大鼠肠黏膜组织内ZO-1蛋白表达量分别为1.825、0.79、1.25、1.16；claudin-1蛋白表达量分别为0.58、0.13、0.43、0.37；occludin蛋白表达量分别为1.06、0.38、0.82、0.79。ANP组均显著低于其他3组，差异均有统计学意义(P值均<0.05，图3)，而CB组与SB组间的差异无统计学意义(P<0.05)。

注：ANP为急性坏死性胰腺炎；CB为酪酸梭菌；SB为丁酸盐图1 对照组(1A)、ANP组(1B)、CB组(1C)和SB组(1D)胰腺组织病理改变(HE染色 ×100)

注：ANP为急性坏死性胰腺炎；CB为酪酸梭菌；SB为丁酸盐图2 对照组(2A)、ANP组(2B)、CB组(2C)和SB组(2D)肝脏组织病理改变(HE染色 ×100)

注：ANP为急性坏死性胰腺炎；CB为酪酸梭菌；SB为丁酸盐图3 对照组(1)、ANP组(2)、CB组(3)、SB组(4)大鼠回肠组织紧密连接蛋白表达

据报道，超过80%的SAP患者可出现短时间或持续的肝功能异常，而胰腺炎相关肝损伤的发生与SAP早期炎性反应失控密切相关[10]。肝损伤后肝脏清除率及解毒功能下降，各种致病物质更易进入体内循环，为全身炎症反应综合征的发生提供了基础，促进多器官功能障碍形成，可见保护肝脏可延缓多器官功能障碍的发生，提高临床治愈率[11]。

肠道菌群是宿主共生微生物的大蓄水池，与宿主协同共存，保持着动态平衡，提供有益于宿主的生物和代谢功能，参与保护肠道屏障、营养代谢、调节免疫等过程[12-13]。肠功能障碍是SAP常见并发症，也是促进病情发展甚至诱发多器官功能障碍的重要原因。肠道功能障碍包括肠黏膜屏障损伤和肠道动力障碍，研究表明肠道菌群可通过影响肠黏膜上皮细胞更新、肠道通透性、肠道抗菌肽的释放及肠道黏液层等调节肠黏膜屏障功能[14]。近年来，益生菌对各种肠道疾病的治疗作用受到极大关注，Bongaerts和Severijnen[12]提出应该在胰腺炎初期应用大量有代谢活性的益生菌，才能起到调节肠道菌群紊乱，减少后期继发感染，从而改善AP疾病病程。酪酸梭菌是一种常见的肠道共生菌，该菌及其代谢产物丁酸可抑制各种肠道有害细菌发育，减少其增殖及产生毒素，减少炎症因子释放，修复肠道屏障并维持其稳定。本研究结果显示，酪酸梭菌或丁酸盐干预后大鼠腹腔内压力、腹水量较未干预组明显降低，且TNF-α、IL-6水平显降低，说明酪酸梭菌能有效降低ANP大鼠体内炎症反应，减轻AP疾病严重程度。

目前已有研究报道梭菌族Ⅳ和硬壁菌ⅪVa是肠道中产生短链脂肪酸的主要菌，且有证据表面短链脂肪酸在减少肝脏炎症中有一定作用[15]。短链脂肪酸不仅可以为机体肠黏膜细胞提供能量，调节肠道PH，还可以维持肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白的完整性，改善肠黏膜屏障功能[16]。本研究结果表明，酪酸梭菌、丁酸盐干预组大鼠AST、ALT、TBil水平明显下降，且ANP组大鼠紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin1的表达明显低于对照组，经酪酸梭菌或丁酸盐干预后ZO-1、occludin、claudin1的表达明显升高，说明在ANP大鼠模型中酪酸梭菌或丁酸盐可起到保护肝损伤的作用，补充酪酸梭菌或丁酸盐可明显增强肠黏膜屏障功能，改善ANP并发肝损伤的严重程度。

总之，酪酸梭菌及其代谢产物丁酸盐既能减轻ANP合并肝损伤大鼠体内炎症反应、维护其肠屏障功能，又能明显缓解ANP大鼠体内肝脏损伤，这一结果为酪酸梭菌治疗SAP合并肝损伤提供了实验依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突