饲用益生菌丁酸梭菌抑菌性能的研究

肖明霞，王乙茹，柳成东，屈 娥，赵 平，程志斌*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.达州职业技术学院，四川达州 635001）

饲用益生菌等安全添加剂的筛选与评估一直是饲料添加剂领域的重要方向之一，尤其是2020 年后我国饲料工业禁用了以促生长为目的的药物类饲料添加剂。近年来，丁酸梭菌（）成为行业研究与应用的热点之一，大量饲养试验表明饲用丁酸梭菌通过显著抑制畜禽肠道主要有害菌实现生产性能的改善；也有报道称丁酸梭菌未能显著改善畜禽生长性能。以上矛盾的结论提示，丁酸梭菌饲用价值的动物试验评估结果不稳定，可能受试验材料（丁酸梭菌菌株）、试验设计、养殖动物、饲养条件等差异化条件的影响，且动物试验所需的费用高、周期长。所以，通过实验室益生菌评估技术，能够科学、高效的初筛益生性能突出的丁酸梭菌菌株，这有助于提高后续动物饲养试验的可重复性和研发效率。

抑菌性能是饲用益生菌发挥益生性能的关键评估指标，也是替代抗生素改善畜禽生产性能的重要机制之一。根据现有牛津杯法评估丁酸梭菌抑菌性能的报道，发现两个问题：①未系统研究丁酸梭菌的抑菌作用。目前，报道丁酸梭菌对致病大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的文献较多，但对肠道有益菌及其他商业饲用益生菌抑制作用研究的报道极少；②抑菌效果不明确。现有涉及丁酸梭菌抑菌性能评估的试验报道中，未见以抗生素为对照组的实验设计，这不利于比较确定丁酸梭菌的抑菌效果。随着世界畜牧业“禁抗”的发展趋势，丁酸梭菌等替抗饲用益生菌制剂的研发必须重视产品的抑菌作用及其效果。据此，本研究采用牛津杯法，设计土霉素为对照组，对比评估丁酸梭菌对畜禽肠道主要有害菌、肠道主要有益菌、饲料源有害菌、商业饲用益生菌的抑制作用及效果，为丁酸梭菌在养殖业的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 丁酸梭菌（）由课题组前期从云南地方品种猪“大河猪”的养殖场中分离获得，经16sRNA 鉴定命名为丁酸梭菌YNAU 3318，用于本次抑菌性能评估。土霉素购买于叶源生物有限公司。土霉素抑菌浓度400 mg/L，参考课题组前期报道。

1.2 试验设计 为全面评估畜禽饲用丁酸梭菌的抑菌性能，包括其对有害菌（肠道主要有害菌、饲料源有害菌）的拮抗效应，以及对有益菌（肠道主要有益菌、其他商业饲用益生菌）可能的拮抗效应，本研究设3 个处理组，即阳性对照组（土霉素组）、阴性对照组（无菌蒸馏水组）、丁酸梭菌组，采用牛津杯法评估丁酸梭菌对4 类14 个指示菌的抑制效果，4 类指示菌的选择依据实际畜禽养殖生产问题及复合益生菌产品研发的需求进行创新研究，见表1。指示菌购于北京百欧博伟生物科技有限公司和北纳创联生物科技有限公司。

表1 14 个指示菌的分类及菌株编号

1.3 牛津杯抑菌试验步骤及抑菌作用判定

1.3.1 丁酸梭菌及指示菌的培养 丁酸梭菌采用RCM培养基，厌氧培养24 h。指示菌大肠杆菌K88 和K99、猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等采用LB 培养基，培养24 h。产气荚膜梭菌采用血琼脂培养基，厌氧培养24 h；指示菌罗伊氏乳酸杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母、凝结芽孢杆菌等采用MRS 培养基，培养24 h。嗜热双歧杆菌采用BBL 培养基，厌氧培养48 h。以上指示菌的培养基，其成分及培养条件参照课题组前期报道。

1.3.2 制备指示菌涂布平板 平板涂布采用MRS培养基，配制好后将其放置121℃高压蒸汽灭菌锅灭菌30 min，在每个培养皿倒入15～20 mL MRS 培养基，凝固后涂布。

1.3.3 牛津杯抑菌操作 吸取经培养24 h 或48 h 的指示菌菌液800 µL，转入装有7.2 mL 无菌水的EP 管，将指示菌浓度稀释10涂布。为比较土霉素、无菌蒸馏水、丁酸梭菌对某一个指示菌的抑制作用，取200 µL指示菌稀释液涂布，放置3 个牛津杯在培养皿中，各注入土霉素、无菌蒸馏水、丁酸梭菌菌液200 µL。培养皿置于恒温箱37.5℃培养，除指示菌凝结芽孢杆菌、嗜热双歧杆菌培养48 h 外，其他12 个指示菌培养24 h。以上操作每个指示菌做3 个重复，并平行测定3 次。抑菌圈直径（Diameter Of Inhibition Zone，DIZ）用游标卡尺测量。

1.3.4 抑菌作用判定 以DIZ 的最大值和最小值的平均值确定DIZ，并判定抑菌作用。由于丁酸梭菌抑菌作用没有统一的判定标准，依据实测DIZ 数据范围，并参考谢丽静等和罗璠等报道，抑菌作用的判定标准为：“不敏感”：DIZ=7.8 mm；“低敏感”：7.8 mm12.0 mm。

1.4 统计分析 采用SAS9.2 统计软件对抑菌圈直径数据进行单因素方差分析和LSD 多重比较，<0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 丁酸梭菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用 由表2 和图1 可知，丁酸梭菌对大肠杆菌K88、猪霍乱沙门氏杆菌的抑菌作用达“高敏感”（DIZ>12.0 mm），对大肠杆菌K99、产气荚膜梭菌的抑菌作用为“中敏感”（10 mm

图1 丁酸梭菌对肠道主要有害菌的抑制作用

表2 丁酸梭菌与无菌蒸馏水、土霉素对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用 mm

2.2 丁酸梭菌对畜禽肠道主要有益菌的抑制作用 由表3 及图2 可知，丁酸梭菌对肠道有益菌（罗伊氏乳酸杆菌和嗜热双歧杆菌）的抑制作用“不敏感”。土霉素“高敏感”抑制罗伊氏乳酸杆菌，但对嗜热双歧杆菌“不敏感”。此外，无菌蒸馏水对罗伊氏乳杆菌、嗜热双歧杆的抑菌作用均为“不敏感”。

图2 丁酸梭菌对肠道主要有益菌罗伊氏乳酸杆菌（A）、嗜热双歧杆菌（B）的抑制作用

表3 丁酸梭菌与无菌蒸馏水、土霉素对畜禽肠道主要有益菌的抑制作用 mm

2.3 丁酸梭菌对饲料源有害菌金黄色葡萄球菌的抑制作用 由图3 可知，丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌的抑菌作用达“高敏感”（DIZ=13.0 mm），但抑制效果低于（<0.001）土霉素（DIZ=28.4 mm）。此外，无菌蒸馏水对金黄色葡萄球菌无抑制作用，抑菌作用判定“不敏感”。

图3 丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用

2.4 丁酸梭菌对主要商业饲用益生菌的抑制作用 由表4 和图4 可知，丁酸梭菌对凝结芽孢杆菌的抑制作用达“高敏感”，对地衣芽孢杆菌的抑制作用为“中敏感”，对枯草芽孢杆菌的抑制作用为“低敏感”，对屎肠球菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母的抑制作用判定为“不敏感”。土霉素对凝结芽孢杆菌、屎肠球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用达“高敏感”，且抑制效果大于丁酸梭菌（<0.001）；土霉素对粪肠球菌、产朊假丝酵母的抑制作用判定为“不敏感”。此外，无菌蒸馏水对以上6 个指示菌的抑制作用均判定为“不敏感”。

表4 丁酸梭菌与无菌蒸馏水、土霉素对主要商业饲用益生菌的抑制作用 mm

图4 丁酸梭菌对主要商业饲用益生菌的抑制作用

3 讨论

3.1 丁酸梭菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用 致病大肠杆菌、沙门氏菌是畜禽肠道常见致病菌，感染畜禽出现腹泻、下痢等症状，导致生产性能下降。本研究显示，丁酸梭菌对大肠杆菌K88、猪霍乱沙门氏菌的抑制作用为“高敏感”，对大肠杆菌K99 的抑制作用为“中敏感”，表明丁酸梭菌对畜禽肠道主要有害菌有较好的抑制作用。谢丽静等采用牛津杯法判定丁酸梭菌对大肠杆菌的抑制作用为“高敏感”；贾丽楠等研究显示丁酸梭菌对大肠杆菌的抑制作用为“中敏感”；肖海蒂评估了3 株丁酸梭菌（菌株编号D-2、D-8、D-19）对大肠杆菌的抑制作用，其中2 株达“高敏感”、1 株为“中敏感”。此外，王倩等研究结果显示丁酸梭菌对猪霍乱沙门氏菌的抑制作用为“高敏感”。以上报道与本研究结果基本一致。

产气荚膜梭菌是引发家禽坏死性肠炎的致病菌，感染家禽死亡率高，严重危害家禽生产性能。仅有的2 篇体外抑菌试验报道显示，丁酸梭菌对产气荚膜梭菌的抑制作用为“低敏感”和“不敏感”。本研究首次发现丁酸梭菌对产气荚膜梭菌的抑制作用为“中敏感”，提示不同菌株的丁酸梭菌对产气荚膜梭菌的抑制作用有显著差异。Yang 等和Abdel-Latif 等研究显示，与对照组比，饲粮添加丁酸梭菌显著降低肉鸡肠道产气荚膜梭菌的数量，从而改善了生长性能。Zhang等进一步用攻毒试验模型证明，饲用丁酸梭菌显著降低感染肉鸡的肠道产气荚膜梭菌数量，平衡肠道菌群。本次体外评估丁酸梭菌对产气荚膜梭菌抑菌作用的结果与上述报道的饲用丁酸梭菌能抑制肠道产气荚膜梭菌的结论相符。

丁酸梭菌对5 个畜禽肠道主要有害菌的抑制效果整体弱于土霉素。Han 等报道，与抗生素组相比，丁酸梭菌组断奶仔猪的粪便成形度评分显著较差。Han 等研究显示，丁酸梭菌组肉鸡1～21 日龄的耗料增重比显著高于抗生素组。Zhang 等采用大肠杆菌攻毒肉鸡试验证明，28 日龄采食丁酸梭菌饲粮组肉鸡体重比采食抗生素饲粮组肉鸡体重低约6.0%。以上比较饲用丁酸梭菌与抗生素对猪鸡生长性能影响的结果，与本次体外抑菌试验结果相符。

3.2 丁酸梭菌对畜禽肠道主要有益菌的抑制作用 乳酸杆菌和双歧杆菌是畜禽肠道的常在优势菌群，鉴于土霉素等广谱抗生素对肠道有益菌的拮抗效应，评估丁酸梭菌对肠道主要有益菌可能的抑菌作用十分必要。本研究显示，丁酸梭菌对罗伊氏乳杆菌、嗜热双歧杆菌无抑制，这与朱晓慧等报道一致。另外，土霉素对罗伊氏乳杆菌的抑制达“高敏感”。以上结果提示，与抗生素相比，丁酸梭菌与肠道主要有益菌无拮抗效应，丁酸梭菌维持畜禽肠道菌群平衡的效果优于抗生素。动物试验也显示，饲用丁酸梭菌不同程度地增加了畜禽肠道乳酸杆菌和双歧杆菌数量，这对改善畜禽生产性能有积极作用。

3.3 丁酸梭菌对饲料源有害菌金黄色葡萄球菌的抑制作用 金黄色葡萄球菌是饲料及饲料原料重点监测的有害菌之一，畜禽摄入金黄色葡萄球菌污染的饲料及饲料原料，危害畜禽健康。由于土霉素等广谱饲用抗生素能够显著抑制金黄色葡萄球菌，但当前“禁抗”形式下须重新审视这一实际生产问题。本研究结果显示，丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用达“高敏感”，与前人的报道基本一致，表明饲粮添加丁酸梭菌具有预防畜禽感染饲料源金黄色葡萄球菌的作用。诚然，丁酸梭菌对金黄色葡萄球菌的抑制效果显著低于土霉素。

3.4 丁酸梭菌对主要商业饲用益生菌的抑制作用 我国《饲料添加剂品种目录》（2013）收录了34 种饲用益生菌，当前推广应用较多的包括丁酸梭菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌及凝结芽孢杆菌。本研究重点评估了丁酸梭菌对以上6 个主要商业饲用益生菌的抑制作用，结果显示丁酸梭菌对枯草芽孢杆菌的抑制作用为“低敏感”，对粪肠球菌、屎肠球菌、产朊假丝酵母的抑制作用均为“不敏感”。仅有的1 篇体外抑菌试验显示，丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌、粪肠球菌无拮抗效应，该报道建议丁酸梭菌可以与枯草芽孢杆菌、粪肠球菌组合应用。Abdel-Latif 等通过饲养试验评估饲用丁酸梭菌、酵母菌单一及组合应用对肉鸡生产性能的影响，结果显示与单一添加丁酸梭菌组比，组合使用丁酸梭菌和酵母菌的肉鸡死亡率显著降低、盲肠有益菌乳酸杆菌显著增加。Abdel-Latif 等建议推广丁酸梭菌与酵母菌的复合饲用益生菌产品。

本研究首次通过体外抑菌试验发现，丁酸梭菌对凝结芽孢杆菌的抑制作用达“高敏感”，这提示丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌之间存在拮抗效应。樊英等评估了丁酸梭菌和凝结芽孢杆菌单一及组合应用对虹鳟鱼生产性能的影响，结果显示与基础饲粮的对照组比，单一应用丁酸梭菌或单一应用凝结芽孢杆菌均能显著提高虹鳟鱼肠道优势有益菌比例，改善生长性能；然而，与单一的丁酸梭菌组、凝结芽孢杆菌组比，组合应用丁酸梭菌和凝结芽孢杆菌组的虹鳟鱼肠道优势有益菌比例没有进一步提升、生长性能也未能明显改善，结果表明饲粮单一添加丁酸梭菌或凝结芽孢杆菌有利于虹鳟鱼养殖生产，但二者组合使用未能进一步提高生产性能。以上结果验证了本研究丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌之间的拮抗效应。

丁酸梭菌与枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、产朊假丝酵母没有拮抗效应。然而，丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌之间存在拮抗效应，建议畜禽饲料中的组合应用需谨慎考虑。

4 结论

本研究采用牛津杯法首次较为系统地评估了丁酸梭菌的抑菌性能，为饲粮添加丁酸梭菌平衡畜禽肠道菌群及促生长的作用效果提供了科学依据。此外，建议商业复合饲用益生菌应充分考虑丁酸梭菌与其他益生菌之间可能的拮抗效应。