我国首例Paraconiothyrium cyclothyrioides感染致眼内炎的相关研究

吴丽莎 朱红军

(汕头市中心医院检验科，汕头 515041)

眼部真菌感染是一种治疗棘手且易致视力损害的眼部感染性疾患，是致盲的主要因素之一。Paraconiothyriumcyclothyrioides是一种罕见的条件致病性真菌，随着检测手段的进步，逐渐可见其感染人类的报道，但目前对其诊断和治疗仍然缺乏系统性的数据。我院诊断了1例眼外伤导致的Paraconiothyriumcyclothyrioides感染眼内炎。尽管对该患者进行了外科治疗和氟康唑及伊曲康唑联合抗真菌治疗，但其感染仍未能得到控制，最终进行了左眼剜除术。由于实验室在鉴定这类少见丝状真菌时缓慢且临床数据有限，导致临床对这类罕见真菌如Paraconiothyriumcyclothyrioides感染的诊治困难，目前主要依赖于外科手术和抗真菌治疗的结合。现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象

患者,男，75岁，因“左眼被竹枝弹伤致视物模糊、红痛半年”于2017年3月14日来我院就诊。眼科检查显示：左眼结膜充血，角膜12点方位至角膜中央可见纵向伤口长约6 mm，其周角膜变性混浊，前房极浅，中轴约1CT，房水混浊+++，伤口附近可见团状乳白色渗出物，对光反射消失，晶体全乳白混浊。右眼正常。入院后完善相关检查后，于2017年3月17日行左眼角膜创口修补、前房取材、冲洗术，术中抽取前房沉积物，并送微生物检查。临床诊断考虑左眼真菌性眼内炎，术后给予头孢呋辛、氟康唑、伊曲康唑进行常规抗菌治疗，外用左氧氟沙星滴眼液等。经治疗后病情有改善，左眼感染有所控制，伤口缝线在位，密闭性可，患者要求出院。患者出院1个多月后，症状反复，再次来我院就诊，因其真菌性眼内炎并发角膜穿孔，晶体脱出嵌顿，眼前节失去正常结构，无复明希望，进行左眼眼内容剜除术。术后继续给予伊曲康唑抗真菌治疗，症状好转。

1.2 方法

菌株培养 将术中抽取送检的前房沉积物常规接种于血平板、麦康凯平板置于35℃培养，2个马铃薯葡萄糖琼脂(PDA平板)，1个置于35℃培养，另1个置于25℃培养，并观察其生长情况。

分子生物学鉴定分析 使用北京六合通经贸有限公司购买的PCR反应试剂盒(Takara，R011)对ITS基因序列进行PCR和测序分析。测序结果在NCBI网站genebank序列库进行比对分析。采用MEGA7.0软件构建系统发生树，分析方法为邻接法(neighbor joining method)，使用Kimura 2参数模型，bootstrap次数设置为1000。

2 结 果

培养结果 PDA培养基25℃生长速度较快，48 h可见菌落生长，直径约3 cm，初期为浅米色细绒毛状周边有白色绒毛圈，表面有皱褶的菌落，随着培养时间延长，菌落颜色逐渐加深，变为灰绿色或橄榄色，周围有白色绒毛圈，呈柔软表面有皱折的绒毛状(见图1、2)。培养7 d后呈深橄榄色，呈粉末状扩散的菌落(见图3)。

该菌在35℃下生长缓慢，4 d左右方可见米粒大小的白色凸起菌落，15 d左右菌落稍有增大，呈皱褶凸起状，中间黄褐色，外周有白色绒毛圈，气生菌丝较少(见图4、5)。

用透明胶纸沾取该菌并用乳酸酚棉兰染色，镜下可见大量结节状分隔菌丝，光滑，呈不规则树枝样分枝，未见分生孢子(见图6)。延长培养时间，进行小培养均未见产孢。

分子生物学鉴定结果 该菌ITS测序结果与GenBank中Paraconiothyriumcyclothyrioides对应序列的相似度在99%以上，该菌株的ITS序列已经提交至Genebank数据库，序列号为MK903525。利用MEGA7.0构建的基于ITS序列的种系发生树如图7所示，可见其与Paraconiothyriumcyclothyrioides序列一致。

3 讨 论

本病例的患者因竹子划伤眼睛后导致真菌性眼内炎，经常规细菌培养及ITS测序后确认为Paraconiothyriumcyclothyrioides感染的真菌性眼内炎，该患者经常规手术和抗真菌药物治疗后效果不佳，病情进一步恶化，随后进行左眼眼内容剜除术，丧失一侧视力。经卫生部医药卫生科技项目查新报告显示国内未见有Paraconiothyriumcyclothyrioid感染性眼内炎的公开研究报道，所以这是国内首次报导的由Paraconiothyriumcyclothyrioides引起的真菌性眼内炎。

本病例中培养到的Paraconiothyriumcyclothyrioides的特点主要有以下几个方面：①生长速度：25℃生长快速，2 d即可见明显的浅绿色毛绒状菌落，直径约3 cm，4 d左右成熟；35℃生长缓慢，4 d左右可见小且凸起的白色菌落，直径约0.5 cm，延长培养时间至15 d其菌落约生长至1 cm；②菌落形态：25℃培养初期呈浅米色毛绒状菌落，随培养时间延长颜色逐渐加深，呈灰绿色，外周有白色绒毛，菌落中央有放射状沟，气生菌丝较丰富；35℃培养初期呈针尖样突起皱褶的白色菌落，随培养时间延长变化不大，菌落稍有增大且凸起，表面凹凸不平有皱褶，颜色稍有加深变浅绿色，气生菌丝少；③镜下形态：25℃和35℃培养镜下均未能见到孢子，可见密集的竹节样分隔菌丝，光滑呈不规则树枝样分枝。④该菌形态学没有典型的结构，因此很难从形态学对其进行鉴定，ITS测序结果与GenBank中Paraconiothyriumcyclothyrioides对应序列的相似度在99%以上，该菌株的ITS序列已经提交至Genebank数据库，序列号为MK903525；⑤由于该菌株不产孢，故未能进行药敏试验。

Paraconiothyriumcyclothyrioides是引起人类真菌感染的一种罕见真菌，是一种条件致病性真菌，目前认为其危险因素包括免疫抑制和外伤等。该菌最早于1995年在巴布亚新几内亚收集的土壤样品中分离出来[1]，其临床报导病例较少。

图1 PDA 25℃ 培养48 h，菌落呈浅米色细绒毛状，周边有白色绒毛圈，表面有皱折 图2 PDA 25℃ 培养96 h,菌落颜色逐渐加深，呈灰绿色 图3 PDA 25℃ 培养7 d，菌落颜色加深为深橄榄色，呈粉末状扩散 图4 PDA 35℃ 培养96 h，生长缓慢 图5 PDA 35℃ 培养15 d，菌落呈呈皱折凸起状，中间黄褐色，外周有白色绒毛圈，气生菌丝较少 图6 乳酸酚棉兰染色镜下形态，可见大量结节状分隔菌丝，光滑，呈不规则树枝样分枝，未见分生孢子(×40)

图7 该菌与Genebank其他近源菌株ITS序列系统发生分析图

2007年Balajee等[2]最早报道了1例接受肝脏移植的3岁儿童，移植后1年在一侧下肢出现一溃烂病变，并从其病变部位培养到丝状真菌，其测序结果为Paraconiothyriumcyclothyrioides，但该报道没有提供关于感染的临床进展和治疗信息。

2012年Rachel等[3]报道了1例肾移植患者因Paraconiothyriumcyclothyrioides感染引起的下肢皮肤感染溃烂的病例，该患者在肾移植后左膝前内侧出现一无痛、无瘙痒的溃烂斑块，在治疗开始口服伏立康唑(200 mg/12 h)，但效果不佳，随后从病变部位的活检物中培养到丝状真菌，经ITS测序后确定为Paraconiothyriumcyclothyrioides，患者开始使用两性霉素B脂质复合物(静脉注射400 mg/d)和米卡芬净(静脉注射100 mg/d)。但由于患者肌酐水平升高，出现肾损害，于是停用两性霉素B和米卡芬净，改用泊沙康唑(口服400 mg/12 h)治疗。在使用泊沙康唑治疗后10 d，该患者的皮损病变明显改善。出院后继续使用泊沙康唑持续治疗4周。随后其病变完全消失痊愈。同时该报道研究表明Paraconiothyriumcyclothyrioides在PDA上生长时， 27℃时生长速度最佳，而在35℃时生长最慢，该菌在PDA 25℃培养6 d可见羊毛状灰橄榄色外周有白色绒毛圈菌落，可见其生长温度、生长速度及菌落形态均与本研究相符合。同时该研究还在25℃条件下用CLA琼脂(carnation leaf agar)培养4周后，镜下可见有红棕色、透明的圆柱形厚壁分生孢子，由此可见Paraconiothyriumcyclothyrioides需要在特定的培养基及较长的培养时间方可产生分生孢子。

由于本研究中实验条件有限，且该菌株不产孢，故本研究未能进行药敏试验，且该菌的体外药敏试验尚无标准，目前没有相关的药敏报道。Rachel[3]认为Paraconiothyriumcyclothyrioides在对唑类抗真菌药物敏感性方面存在差异性，该患者对伏立康唑治疗没有效果，但在改为泊沙康唑治疗后有明显的疗效，其病灶消退并痊愈。而两性霉素B因为其肾毒性停药，无法判断其疗效。本研究中的患者使用氟康唑和伊曲康唑治疗后效果不佳，最终因真菌性眼内炎并发角膜穿孔，晶体脱出嵌顿，采取手术切除左眼后治愈，可见Paraconiothyriumcyclothyrioides对抗真菌药存在明显的差异性，其药物敏感性仍需进一步研究，可见临床治疗中若能对少见真菌进行早期准确鉴定，临床治疗中就可参考相关文献及根据实际情况进行抗真菌药物的选择和更换。

眼部真菌感染具有难治疗、预后差的特点，是致盲的主要原因之一。引起眼部真菌感染的主要致病菌为镰刀菌等,但也有许多无法通过形态学鉴定的不产孢的丝状真菌。何宏等[4]对眼部真菌感染的患者中分离到的不产孢子菌进行ITS测序，19株不产孢子菌包括可可毛色二孢子菌6株、月状弯孢霉1株、节菱孢霉菌2株、Neodeightoniasubglabosa2株、红贝菌1株、肉座菌1株、多喙茎点霉1株、红色毛癣菌1株、深海曲霉菌1株、Roussoellasiamensis1株、撕列蜡孔菌1株、茄病镰刀菌1株。不产孢子菌在眼病致性真菌谱中占据非常重要的位置(仅次于镰刀菌)，而Paraconiothyriumcyclothyrioides目前国内仍未见报道。ITS基因测序可准确地鉴定不产孢子菌的种属。

基因序列分析被认为可作为丝状真菌鉴定的“金标准”[5]，位于核糖体RNA基因大小亚单位之间的ITS序列分析可将大多数真菌鉴定到种，ITS即内转录间隔区，是真菌核糖体RNA基因中度保守区域，在生物进化中能容忍更多的变异，不同种属真菌的ITS序列表现出较高的特异性，且片段短易于扩增，目前已经被广泛应用于丝状真菌的鉴定[6,7]。

Paraconiothyriumcyclothyrioides是一种罕见的条件致病性真菌，免疫功能低下和外伤是重要的高危因素，其形态学没有特征性，难以从形态学进行鉴定，本病例是国内首次报导的由Paraconiothyriumcyclothyrioides引起的真菌性眼内炎。目前绝大多数实验室对丝状真菌的鉴定主要依赖于形态学鉴定，但由于丝状真菌各类繁多、形态各异，对于形态结构不典型或少见的丝状真菌，传统的形态学鉴定方法往往不能得到准确的鉴定，需要借助于基因序列分析。同时本研究的病例提示对于外伤性眼部感染在常规抗菌药物治疗无效，病情持续进展的情况下除考虑常见的真菌感染外，还应特别注意少见真菌的感染，及时进行基因测序及更换合适的抗真菌药物。