柔毛淫羊藿四川主产区种质资源的质量特征研究

★蒋勇 黄华 李仁清 徐艳琴 曾金祥（.江西中医药大学药学院 南昌 330004；.江西中医药大学中药资源与民族药研究中心 南昌 330004）

药用植物种质资源是中医药产业的源头和人类健康需求的保障，也是中药基础研究及创新体系建设的物质基础［1-2］，已成为国家重要的生物战略性资源［3］。对于药用植物，有效成分丰富的种质为选择和利用的首选［3-5］。系统的质量评价可有效指导野生资源利用及人工种植种质和生境的选择［6］。

淫羊藿为我国传统中药材，逐渐步入大宗品种行列，在中药产业中占有重要地位，为最具开发潜力和重点研究的药物之一［7-8］。优质与充足的淫羊藿资源是相关医药产品健康可持续发展的重要保障与支撑［9］。为保证药品安全有效和稳定可控，药材质量评价成为淫羊藿众多研究方向中的重点和热点［10-13］。开发淫羊藿，尤其是药典收录种的优异种质筛选成为迫在眉睫的问题。对保障资源供应，促进资源合理开发和利用具有重要意义。

柔毛淫羊藿（Epimedium pubescensMaxim.）历来为药典收录种，是淫羊藿属分布较广的物种，尽管陕西省南部、甘肃省东南部和重庆市有少量分布，但主产区为四川省［14-16］。柔毛淫羊藿为淫羊藿药材七大主流品种之一［17］，市场占有量达到39%［14］，其质量一直备受关注。但不同研究差异较大，样本合格率从完全不达标0.0 %［18］到46.2 %［19］、52.2 %［20］、57.1 %［21］、66.7 %［12］、68.4 %［22］、83.3 %［23］和85.7 %［24］不等。分析其原因，由于不同研究所采用样品来源不同［19-24］，或者为药店购买的样本［12,18］，采收期信息不详，而不同采收期淫羊藿含量变化差异大［25］。因此，研究结果易出现时高时低情况，缺乏可比性。推荐淫羊藿质量评价研究选择易判断和易统一的采收期，即花期。此外，以往研究仅凭少数的样本对淫羊藿含量检测是不够的全面的，因为淫羊藿物物种内会存在含量差异。综合各方面因素考虑，既要保证有代表性，又要使样本数量可操作范围内，建议参考居群遗传学的取样策略［25］。

优异种质筛选和利用需以系统的质量评价为基础。为剔除采收期对研究结果的影响，本研究所有样本均采自花期。同时，为保证研究结果具有统计学意义，严格按照居群取样策略，分析样本覆盖柔毛淫羊藿四川主产区。采用高效液相色谱法，测定其叶片中4种主要活性成分，进行系统质量评价和质量特征分析，为柔毛淫羊藿优异种质发掘、资源合理开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent Technologies Series 1260高效液相色谱仪、Chem Station工作站（Agilent 科技公司）；CP124S 型万分之一电子天平（Sartoriu公司）；KQ-300DE超声波清洗器（昆山市超声有限公司）。

甲醇与乙腈（色谱纯，美国ACS公司）；乙醇（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；对照品朝藿定A（批号120514）、朝藿定B（批号120518）、朝藿定C（批号120601）和淫羊藿苷（批号120423）购于四川省维克奇生物科技有限公司，质量分数均大于98 %。

1.2 实验材料 柔毛淫羊藿分析样本经江西中医药大学药学院葛菲教授鉴定为E. pubescens Maxim.。于2015年和2017年花期采自四川省主产区的9个代表性产地（表1，图1），每居群采集20～30个个体的成年叶片材料（但SCYA和SCYX居群由于居群过小或物候期影响，仅采集到9～11份合格样本）。

表1 柔毛淫羊藿和采样信息

图1 柔毛淫羊藿采样分布图以及ABCI含量柱状图

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件和方法 色谱条件和方法参照本课题组已发表论文［10］，该色谱条件下的混合对照品及样品色谱图见图2。

1.3.2 数据分析方法 各居群朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷和淫羊藿多苷的平均含量及居群内个体间的标准差采用SPSS 21.0数据分析软件进行统计。为考察主要生态因子对各成分积累的影响，各含量与经度、纬度和海拔高度的相关性分析使用SPSS 21.0皮尔森系数法进行双侧显著性检验。并运用DPS 9.01软件对4种含量与生态因子进行灰色关联度分析。居群间差异使用MVSP 3.1软件进行主成分分析（principal component analysis,PCA）和聚类分析（cluster analysis）［26］。

图2 朝藿定A、B、C和淫羊藿苷混合对照品及柔毛淫羊藿9个居群的代表性HPLC图

2 结果

2.1 淫羊藿多苷含量分布规律 从淫羊藿多苷含量在柔毛淫羊藿各居群中的分布来看，不同成分的含量普遍存在较大差异，一般以淫羊藿苷含量最为丰富，朝藿定C含量其次（表2）。其中，SCZX、SCDY、SCBC和SCYL这4个 居 群 淫 羊藿苷的含量远较朝藿定C丰富，淫羊藿苷含量为朝藿定C含量的1.1（SCZX）～3.2（SCBC）倍。SCLY和SCYX居群淫羊藿苷较朝藿定C的含量稍高。但SCYA和SCDX居群为朝藿定C含量最丰富，其中，SCYA居群朝藿定C的含量为淫羊藿苷含量2.2倍，且其朝藿定C含量在所有居群中最高（2.93 %）。朝藿定A和朝藿定B这两种成分，除SCTJ居群低于检测限外，其余普遍存在，但其含量较朝藿定C和淫羊藿苷偏低，且各居群的含量差异较小（朝藿定A：0.14 %～0.47 %，朝藿定B：0.20 %～0.55 %）。

此外，SCYX居群由于淫羊藿苷和朝藿定C含量均偏低，使得4种成分含量相当（0.20 %～0.34 %），SCTJ居群则4种成分均低于检测限（表2）。

2.2 居群间质量差异 以淫羊藿苷含量来看，依据2015版药典淫羊藿苷不得低于0.5 %的质量标准［27］，除SCTJ和SCYX未达到标准，其余居群均达到药典标准。其中，SCZX（2.21 %）、SCYL（1.57 %）、SCDY（1.33 %）和SCYA（1.31 %）居群淫羊藿苷含量较高，为药典标准2.6～4.4倍，SCDX（0.72 %）、SCLY（0.61 %）和SCBC（0.55 %）居群稍高于药典标准（表2）。

朝藿定C为柔毛淫羊藿中含量较突出的成分，除SCTJ居群外，其余居群均检测到朝藿定C，且居群间含量差异非常悬殊，从0.17 %（SCBC）到2.93 %（SCYA），相差17倍。其中，SCYA（2.93 %）和SCZX（1.93 %）含量尤其突出，SCDX（1.2 %）和SCDY（0.97%）居群含量也相对较高，而SCYL（0.64 %）、SCLY（0.53 %）、SCYX（0.27 %）和SCBC（0.17 %）居群含量则相对偏低。

以淫羊藿多苷总量来看，除SCTJ居群外，其余居群含量均超过1.00 %，含量变异范围为1.04 %（SCYX）～5.26 %（SCYA）。参照国家药品标准修订草案淫羊藿多苷高于1.5 %的标准［28］，除SCTJ（低于检测限）、SCYX（1.04 %）和SCBC（1.06 %）居群外，其余居群均达到标准。其中，SCYA和SCZX居群淫羊藿多苷含量分别高达5.26 %和5.06 %，为草案标准的近3.4倍。SCDY（2.86 %）、SCYL（2.80 %）、SCDX（2.50 %）和SCLY（1.81 %）居群为标准的1.2～1.9倍（表2）。

表2 柔毛淫羊藿多苷的含量比较 %

从9个居群各成分的平均含量来看，淫羊藿苷和朝藿定C均为0.96 %，淫羊藿苷平均含量为药典标准的1.9倍，淫羊藿多苷平均含量为2.50 %，为国家药品标准修订草案标准的1.7倍，表明柔毛淫羊藿整体质量优异。

整体来看，SCYA、SCZX和SCDY居群的朝藿定C、淫羊藿苷和淫羊藿多苷含量都在平均值以上，质量优异。SCYL居群淫羊藿和淫羊藿多苷含量均在平均值以上，且淫羊藿苷含量（1.57 %）仅次于最高的SCZX，居群整体质量也较为突出。SCDX居群淫羊藿苷（0.72 %）和淫羊藿多苷（2.50 %）含量均为中等，但朝藿定C（1.20 %）含量突出。SCLY居群淫羊藿苷（0.61 %）和淫羊藿多苷（1.81 %）含量均稍高于标准。SCBC居群淫羊藿苷（0.55 %）含量稍高于药典标准，但淫羊藿多苷（1.06 %）含量低于标准。SCYX居群则淫羊藿苷（0.34 %）和淫羊藿多苷（1.04 %）含量均低于标准。SCTJ居群最为特殊，没有检测到任何一种成分。

2.3 PCA分析和聚类分析 PCA显示第1主成分和第2主成分的贡献率分别为84.89 %和14.55 %（图3），其中第1主成分朝霍定C值最大（0.832），其次是淫羊藿苷（0.524）；第2主成分中淫羊藿苷为（0.845），说明柔毛淫羊藿以朝藿定C和淫羊藿苷含量为主成分。对不同居群综合得分评价，发现SCYA和SCZX居群品质明显优于其他居群，而SCDY、SCYL和SCDX居群得分大于0，拥有较高的朝藿定C和淫羊藿苷含量。SCTJ居群则得分最低（表3）。

表3 柔毛淫羊藿各个居群主成分值

将9个居群进行PCA主成分分析发现，各居群的分布说明居群间质量存在明显差异。9个居群分为4 类（图3）。SCYA居群为第1类，朝藿定C含量为居群间最高，淫羊藿苷含量也较高，但朝藿定C含量显著高于淫羊藿苷。居群SCZX为第2类，朝藿定C含量非常突出，但淫羊藿苷含量更高，为居群间最高。居群SCYL、SCDY和SCDX为第3类，各成分含量及淫羊藿多苷含量均居中，其中SCYL和SCDY居群淫羊藿苷含量大于朝藿定C，而SCDX居群朝藿定C含量大于淫羊藿苷。居群SCBC、SCYX、SCLY和SCTJ为第4类，各成分含量及淫羊藿多苷含量均偏低，淫羊藿苷含量高于朝藿定C。其中，SCTJ居群因4种待测成分均未检测到而得分最低。

图3 基于朝藿定A、B、C和淫羊藿苷量的柔毛淫羊藿9居群PCA分析

聚类分析结果与PCA结果一致，将9个居群分为A、B、C和D四大类（图4）。其中，A类居群淫羊藿多苷和淫羊藿苷含量普遍偏低，继而分为A1和A2亚类。A1包括SCBC、SCYX和SCLY居群，整体淫羊藿苷含量偏低，A2包括SCTJ居群，未检测到任何成分。B类居群淫羊藿苷与淫羊藿多苷含量中等，细分为B1和B2亚类。其中，B1包括SCDY和SCYL居群，淫羊藿多苷含量较高且淫羊藿苷含量高于朝藿定C含量，B2包括SCDX居群，淫羊藿多苷含量较高但朝藿定C含量高于淫羊藿苷含量。C类和D类淫羊藿多苷含量明显高于其他7个居群。C类为SCYA居群，朝藿定C含量为居群间最高。D类为SCZX居群，淫羊藿苷含量为居群间最高。

图4 柔毛淫羊藿基于ABCI含量的聚类分析图

2.4 主要生态因子对含量的影响

2.4.1 相关性分析 柔毛淫羊藿9个居群的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量和ABCI总量与经度、纬度和海拔高度等主要生态因子的相关性分析结果表明，朝藿定A（r=-0.753,P=0.019）、朝藿定B（r=-0.794，P=0.011）、淫羊藿苷（r=-0.757，P=0.018）和ABCI总量（r=-0.762,P=0.017）与经度呈现显著负相关。朝藿定A（r=-0.722，P=0.028）、朝藿定B（r=-0.796,P=0.010）、朝藿定C（r=-0.719，P=0.029）含量和ABCI总量（r=-0.692，P=0.039）与纬度也呈现显著负相关。朝藿定C（r=-0.629，P=0.070）与经度，淫羊藿苷（r=-0.458，P=0.215）与纬度间缺乏显著相关性。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量和ABCI总量与海拔高度不存在显著相关性。

2.4.2 灰色关联度分析 对柔毛淫羊藿不同居群主要活性成分与生态因子灰色关联度分析结果表明，不同生态因子对4种活性成分以及ABCI的影响各不同（表4）。对朝霍定A、朝霍定B和朝霍定C含量影响程度均为东经＞北纬＞海拔。对淫羊藿多苷含量影响程度为北纬＞东经＞海拔。对淫羊藿苷含量影响程度为海拔＞东经＞北纬。

总体上来看，柔毛淫羊藿主成分含量与生态因子之间的灰色关联系数（ri）为0.566 4～0.652 9，表明生态因子与主成分含量关系较为密切。朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C和淫羊藿多苷对经纬度关联性均高于海拔。而淫羊藿苷对于海拔关联度高于经纬度。总体上来看，经度和纬度对于柔毛淫羊藿主要成分关联程度大于海拔。

表4 柔毛淫羊藿主要活性成分与生态因子的灰色关联度

基于以上生态因子对含量影响的分析结果，表明两者间存在密切相关性。就淫羊藿苷及生态因子相关性而言，不同分析软件结果存在一定差异。SPSS 21.0分析结果显示，淫羊藿苷含量仅与经度存在显著负相关性。而DPS9.01分析结果显示，淫羊藿苷含量与海拔关系更密切。对比本研究SCYL和SCBC两个经纬度相近的居群发现，高海拔SCYL居群的淫羊藿苷和朝藿定C含量分别为低海拔SCBC居群的2.9倍和3.8倍（表2）。说明剔除经度和纬度影响后，海拔因子对柔毛淫羊藿主要成分实际上存在影响。

3 讨论

3.1 柔毛淫羊藿质量评述 通过本研究，四川主产区柔毛淫羊藿的质量具有以下特证和结论。

（1）柔毛淫羊藿四川主产区整体质量优异。77.8 %和66.7 %的居群其淫羊藿苷和淫羊藿多苷含量分别达到药典标准和国家药品标准修订草案标准，与以往研究结果趋势一致［21-24］。区别于药典种箭叶淫羊藿（E. sagittatum (Sieb. et Zucc.)Maxim.）和巫山淫羊藿（E. wushanense T. S. Ying）大部分都达不到药典标准［10,12］。

（2）本研究表明，柔毛淫羊藿6个居群以淫羊藿苷含量为最高，SCYA和SCDX居群以朝藿定C为主导。说明柔毛淫羊藿多数居群活性成分主要以淫羊藿苷为主导，与朝鲜淫羊藿（E. koreanum Nakai）类 似［12］，不同 于淫 羊藿（E. brevicornu Maxim.）以朝藿定B含量最丰富［6］，巫山淫羊藿［27］、箭叶淫羊藿［10］和粗毛淫羊藿（E. acuminatum Franch.）［29］普遍以朝藿定C含量最丰富。淫羊藿苷为淫羊藿药材最重要的活性成分，但有报道表明，淫羊藿药材经高温加热后，朝藿定C可转化为淫羊藿苷［30］，暗示无论是淫羊藿苷主导，还是朝藿定C 主导，均为优异种质，但利用时需区别对待。

（3）本研究中，SCTJ居群最为特殊，所有个体均未检测到任何一种成分。本研究多次核查实验材料，确定实验材料无误，且对SCTJ居群30个个体样本进行了多次重复检测，结果均未发现有含量个体。可排除实验材料和操作误差。SCTJ居群位于四川省与陕西省交界处，为其物种分布边缘，可能是由于地理环境因素导致，其特殊性有待进一步研究。

3.2 生境的讨论 经度、纬度和海拔是影响药用植物分布及生长发育的重要环境因子［5,31］。研究这些因子与药用植物中有效成分含量的相关性，不仅有利于探索药材质量形成规律，而且，可为药用植物的栽培和规范化种植提供理论依据。

本研究表明，柔毛淫羊藿四川主产区的居群，除朝藿定C与经度，淫羊藿苷与纬度缺乏显著相关性外，其余含量与经度和纬度均呈显著负相关。未来研究可以考虑进一步开展气候、温度和水分等因素对柔毛淫羊藿活性成分积累影响的研究。

此外，本研究各成分含量与海拔高度均不存在显著相关性，似乎说明海拔高度对质量缺乏影响。但事实是否如此？本研究发现，SCBC和SCYL居群的地理位置相邻，其经度和纬度极为接近，但SCYL居群的海拔高度（1 377 m）远高于SCBC居群（877 m）。质量检测结果表明，SCYL居群的含有目标成分均远高于SCBC居群（表2）。提示海拔高度对柔毛淫羊藿成分的积累可能也具有重要影响。因此，关于海拔对药效成分积累的影响还需要在同一地区不同海拔的多个居群开展研究，即剔除经度和纬度的影响，才能获到较可靠的结论。

3.3 对种质利用的启示 从淫羊藿苷和淫羊藿多苷的含量来看，位于四川省西南部或中部的居群质量均较理想，尤其以西南部的SCYA和SCZX居群最为优异。这与付亮等雅安市上里镇和都江堰市产柔毛淫羊藿质量较优的结果吻合［32］。这些种质应是开发利用的重点，可作为药材规范化栽培优异的候选种质，其生境也可为栽培基地的选择提供参考。SCTJ居群虽不宜作为药用种质。但其特殊性对开展次生代谢产物积累和淫羊藿药材质量形成机制研究或许是非常理想的对照材料。