基于数据挖掘和网络药理学分析旋覆代赭汤治疗反流性食管炎的效用机制

★符小聪 张涛 赖冬萍 丁明健（.江门市五邑中医院脾胃病科 广东 江门 59000；.广西中医药大学附属瑞康医院消化科 南宁 5000；.广西中医药大学 南宁 5000）

反流性食管炎（Reflux Esophagitis, RE）是一种常见的临床慢性炎症性疾病，其发生的主要原因是胃液中含有的胃酸、胆盐及其他有害物质反流进入食管，致使食管黏膜损伤［1］。据相关数据统计显示，RE在全球范围内的发病率高达40 %［2］，其在亚洲的患病率低于欧洲和美洲，但近年来在亚洲有明显上升趋势［3］。目前，临床上通常使用质子泵抑制剂、抗返流药物、胃动力药物和抗抑郁药物来治疗RE。质子泵抑制剂是首选药物，其在抑制胃酸分泌和缓解RE患者疼痛方面是最有效的，但是质子泵抑制剂不能控制RE的关键致病因素，也不能完全治愈RE［4］。并且，长期使用质子泵抑制剂会导致严重的并发症［5］。

现阶段，一些中药方已被用于治疗RE，这些中药方在缓解症状、提高治愈率、减少复发及不良反应方面显示出明显优势［6］。旋覆代赭汤出自东汉张仲景《伤寒论》，由旋覆花、人参、生姜、代赭石、甘草、半夏、大枣七味中草药组成。它对改善患者胃、食管黏膜炎症和临床症状，提高适应病治疗的有效率方面均有一定的作用［7］。此外，相关研究显示，旋覆代赭汤无显著毒副作用，在临床治疗RE患者中没有引起明显的不良反应，但其发挥治疗RE的药理作用机制仍有待阐明。于是，本研究基于大数据库挖掘和网络药理学的方法，旨在探讨旋覆代赭汤对RE的治疗作用机制，重点揭示其可能作用的关键基因和介导的信号通路。本研究将有助于促进旋覆代赭汤的临床应用和新药研发。

1 方法

1.1 反流性食管炎相关靶点的筛选 为了收集RE患者的差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs)数据，在Gene Expression Omnibus（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）数据库中挖掘了mRNA高通量RNA测序和微阵列图谱。mRNA表达数据采用log2算法进行归一化和变换，用Fold change（FC）法检测RE患者组和正常组mRNAs的差异表达。如果｜logFC｜＞1且PValue＜0.05，则将mRNA标记为DEGs。同时利用R语言绘制DEGs火山图。

1.2 旋覆代赭汤有效化合物及对应靶点的筛选 利用TCMSP平台（中药系统药理学分析平台，http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索旋覆代赭汤中旋覆花、人参、生姜、代赭石、甘草、半夏、大枣七味药的主要化学成分，以ADME性质［8］：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18为依据筛选可能入血的有效成分，并进行整理。通过DrugBank数据库筛选出化合物对应的靶点，进行整理并删除重复项。

1.3 “化合物-交集靶点”网络 利用Perl语言获得RE差异表达基因与旋覆代赭汤对应靶点基因的交集靶点。将旋覆代赭汤的有效化合物与其对应交集靶点数据导入Cytoscape 3.7.1软件（http://www.cytoscape.org/）构建“化合物-交集靶点”网络图并进行拓扑分析。

1.4 PPI网络构建与功能模块分析 将交集靶点导入STRING11.0数据库(https://string-db.org)进行分析得到蛋白互作网络，再将蛋白互作信息导入Cytoscape3.7.1软件进行可视化及蛋白相互作用分析。利用MCODE插件对网络进行聚类，以筛选出密集连接的功能模块，利用Cytohubba插件筛选核心关键基因（Hub gene）；再分别利用David在线分析平台和ClueGO、CluePedia插件对所筛选的功能模块及Hub基因进行生物学功能注释和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

1.5 Hub基因-KEGG关系网络图的构建 将得到旋覆代赭汤作用于RE的主要通路与核心Hub基因文件导入Cytoscape3.7.1软件构建“Hub基因-KEGG”关系网络图并进行分析。

2 结果

2.1 RE差异表达基因的确定 从GEO数据库下载符合标准的GSE68698数据集，并利用R软件包“limma”对其进行分析。GSE68698数据集基于GPL6480平台获得，包含7例正常样本和16例RE患者样本。根据FC分析（筛选条件｜logFC｜＞1且adj.PValue＜ 0.05）共检测到186个DEGs，其中表达上调的基因有100个，表达下调的基因有86个（图1）。

图1 GSE68698差异表达基因火山图

2.2 旋覆代赭汤的有效化合物收集及靶点预测 在TCMSP平台以旋覆花、人参、生姜、代赭石、甘草、半夏、大枣为关键词，共搜索到1037个相关化合物。根据设定的筛选条件，筛得旋覆花有效化合物19个、人参有效化合物22个、生姜有效化合物5个、甘草有效化合物92个、半夏有效化合物13个、大枣有效化合物29个，共180个化合物，去重后共得到165个有效化合物成分。应用DrugBank数据库收集并筛选这165个有效化合物对应的靶点，整理全部靶点并删除重复项。其中代赭石为矿物质成分氧化铁（Fe2O3），在现有数据库中未找到相对应的化学成分及对应靶点。

2.3 “化合物-交集靶点”网络图的构建及拓扑分析 应用Perl语言合并获得RE差异表达基因与旋覆代赭汤对应靶点的交集靶点共71个，与交集靶点相互作用的有效化合物115个。将这115个有效化合物与交集靶点数据导入Cytoscape3.7.1软件构建“化合物-交集靶点”网络（图2）。该网络图由186个节点（115个化合物节点和71个靶点节点）和576条边组成，其中三角形代表靶点、椭圆形代表化合物，且红色椭圆形化合物节点表示旋覆代赭汤中7味中药的共同有效化合物。应用Network Analysis插件进一步进行拓扑学分析，根据网络节点的Degree和Betweenness Centrality大小筛选出该网络中的关键化合物（木犀草素、槲皮素、黄芩素、β-胡萝卜素、豆甾醇、千金藤碱、山奈酚、β-谷甾醇、人参皂苷RH2、柚皮素等）及核心 靶点（AKT1、JUN、EGFR、VEGFA、CCNA2、PPARG、CASP3、MAPK1、MMP1等），认为这些化合物及靶点在整个网络中起到桥梁作用。

图2 有效化合物-交集靶点网络图

2.4 旋覆代赭汤治疗反流性食管炎作用靶点的PPI网络构建及MCODE功能模块分析 将71个交集靶点导入STRING数据库，设置置信度大于0.400，并剔除孤立的靶点蛋白，获得蛋白互作信息，利用Cytoscape3.7.1软件进行分析，得到图3A。该网络由71个节点和1176边组成，经网络拓扑学分析可知，节点平均Degree为33.13，大于平均Degree的节点有34个；节点平均Betweenness Centrality为0.0080，大于平均Betweenness Centrality的节点有24个。为了筛选重要模块，利用MCODE插件对网络进行聚类，MCODE可用于识别PPI网络中最密集和最重要的功能模块。设置筛选标准：Degree Cutoff=2、Node Score Cutoff=0.2、Max.Depth=100、以及K-Core=2，运行后获得最重要功能模块（图3C），认为该模块涉及的基因在PPI网络中起到关键功能调控作用。

接着使用David软件对该最重要模块中涉及的基因进行功能分析，GO分析结果显示，在血管生成、细胞增殖、凋亡、蛋白质磷酸化、MAPK级联反应、缺氧和脂多糖介导的信号转导等生物学过程中，重要模块基因富集显著（图4A）。重要模块基因细胞成分的变化主要集中在蛋白质复合物表面、细胞质、胞外间隙、胞外区和细胞核中（图4B）。重要模块基因分子功能的变化主要集中在蛋白激酶结合、转录因子结合、蛋白磷酸酶结合、蛋白质结合和泛素蛋白连接酶结合上（图4C）。KEGG通路分析表明，重要模块基因主要富集在癌症途径、癌症蛋白多糖途径、PI3K-Akt信号通路、灶性粘连、MAPK信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路中（图4D）。

图3 交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用分析及MCODE功能模块

图4 MCODE功能模块基因GO及KEGG分析

2.5 旋覆代赭汤作用于RE的Hub基因选择 利用Cytohubba插件的六种不同算法筛选Hub基因，每种算法均筛选出Top10的Hub基因，如图5所示。将六种算法获得的Hub基因取交集，得到最终的核心Hub基因7个： AKT1、EGFR、JUN、VEGFA、MAPK3、ALB和STAT3，并列举了这些核心Hub基因的名称、缩写及功能（表1）。同时应用ClueGO和CluePedia插件对核心Hub基因进行生物学功能及KEGG通路注释（图6）。结果表明，旋覆代赭汤主要通过作用于这些核心Hub基因调控机体各种生物学过程及各种信号通路的转导以发挥防治RE的作用。

图5 六种不同算法的Hub基因

表1 核心Hub基因的功能作用

图6 核心Hub基因的生物学功能注释分析和KEGG功能注释分析

2.6 旋覆代赭汤作用于RE的Hub基因与KEGG关系网络分析 将得到的旋覆代赭汤治疗RE涉及的主要通路与核心Hub基因文件导入Cytoscape3.7.1软件构建“Hub基因-KEGG”关系网络图（图7）。该网络由26个节点（6个Hub基因节点和20个通路节点）和77条边组成，其中三角形代表通路、圆形代表Hub基因，且节点形状越大表示在该网络中所占权重越大。由图可知，AKT1、EGFR、VEGFA、JUN基因和癌症通路（hsa05200）、癌症中蛋白多糖通路（hsa05205）、PI3K-Akt 信号通路（hsa04151）、ErbB 信 号 通 路（hsa04012）、HIF-1信 号 通 路（hsa04066）、FoxO 信号通路（hsa04068）、黏着斑（hsa04510）、MAPK信号通路（hsa04010）、雌激素信号通路（hsa04915）在该网络中起到核心调控作用。

图7 Hub基因-KEGG关系网络图

3 讨论

在中医理论体系中，RE主要表现为胃酸反流、梅核气、胸痹等。本病的病灶位于胃和食管，与肝、脾、肺、肾、胆密切相关。饮食和情绪等多种因素会导致脾胃功能失调，从而产生RE的症状［9-10］。旋覆代赭汤运用中医阴阳平衡理论辨证论治，根据中药配伍规律，由七味中药组成。其中，旋覆花含有黄铜类和萜类化合物，具有明显的抗菌、抗炎、抗氧化以及促进胃肠道蠕动作用，能显著缓解RE的症状；半夏、甘草、生姜是广泛用于治疗胃肠道疾病的中药，具有抗炎、调节胆汁分泌和改善胃肠黏膜损伤的作用；代赭石含有镁离子，其可在胃肠道内形成一定的渗透压，维持胃肠道内的水分充足，促进胃肠道的规律性蠕动；大枣和人参含有小檗碱和人参皂苷RH2，对RE具有一定的治疗作用［11-12］。中药中的这些成分可单独或协同作用以增强治疗效果。简而言之，旋覆代赭汤的治疗效果可能归因于上述生物活性化合物，但仍需进一步系统探讨。

本研究首次在大数据库挖掘和网络药理学分析的基础上，探索了旋覆代赭汤治疗RE的潜在靶点。结果显示，建立了186个节点、576个交互作用的药物成分-靶点网络，并在药物靶点和RE差异表达基因之间共发现了71个交集靶点。在此基础上，进一步研究了基于交集靶点的PPI网络、基于中心节点的功能模块网络和Hub基因的提取。这些Hub基因节点如AKT1、EGFR、VEGFA、JUN、STAT3和MAPK3主要 富集于癌症通路、PI3K- AKT 信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路和雌激素信号通路等。AKT 即蛋白激酶B，是 PI3K- AKT信号转导途径中一个重要的下游因子，在各种细胞的增殖和凋亡中都是必不可少的［13］。先前的荟萃分析表明，AKT1在正常食管-反流性食管炎-Barrett 食管-异型增生-食管腺癌中异常激活，其激活水平与疾病的阶段显著相关［14］。重要的是，AKT1各种中药的重要药物靶点［15-16］。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是表皮生长因子细胞增殖及相关信号转导的受体，是一种酪氨酸激酶激活的跨膜蛋白［17］。研究表明，EGFR在反流性食管炎的发展进程中表达逐渐升高，且与AKT的表达密切相关。在本研究中，AKT1和EGFR不仅是旋覆代赭汤的重要靶点和RE相关靶点之间发现的交集靶点，而且是PPI模块中的枢纽节点。因此，我们推测AKT1和EGFR等基因可能是旋覆代赭汤治疗RE的潜在靶点。

相关研究认为，细胞炎症因子在RE的发生发展中起重要作用，而炎症因子的激活依赖于细胞内外多条信号通路的转导。已有研究证实PI3K-AKT信号通路参与体内大多数炎症反应，且以往的研究也报道显示AKT与食管的病变密切相关［18］。另外，Zhuang等人也证明PI3K-AKT信号通路的激活在反流性食管炎的发生发展中起关键作用，抑制PI3K-AKT信号通路的转导科减少多种炎症因子的释放，从而控制RE的发展进程［19］。Rafiee等人的研究表明PI3K-AKT和MAPK调节的Hsp70和Hsp27的诱导是调节人食管微血管内皮细胞对酸性pH应激反应的关键机制［20］。此外，在反流性食管炎的食管上皮中，MAPK家族蛋白被发现参与调节紧密连接蛋白，这些紧密连接蛋白是反流性食管炎的敏感标志［21］。研究显示，EGFR 在食管角化细胞中过表达介导了PI3K-AKT和MAPK信号通路的激活，从而促进了细胞的增殖和迁移，使得RE向肿瘤化进展［22］。在本研究中，KEGG通路分析表明AKT1和EGFR等Hub基因主要富集在PI3K-AKT信号通路和MAPK信号通路中。因此，我们推测旋覆代赭汤治疗RE的效用可能是通过靶向AKT1和EGFR等PI3K-AKT信号通路和MAPK信号转导途径来实现的。

综上所述，通过网络药理学方法清晰地阐明了旋覆代赭汤抑制炎症反应的多靶点、多组分作用特点。我们通过几个数据库确定了与旋覆代赭汤和RE相关的潜在靶点。然后，将两类靶点合并取交集获得交集靶点，再将交集靶点进行PPI分析，从交集靶点的PPI网络中得到最重要功能模块及核心Hub基因。最后，我们进行了功能富集分析，以阐明旋覆代赭汤治疗RE的多种机制。旋覆代赭汤治疗RE的直接途径有细胞增殖的调控、脂多糖介导的信号转导、MAPK级联反应和PI3K-AKT信号通路信号通路等。将相关结果与RE的现有治疗方法相结合，我们认为旋覆代赭汤在治疗RE时具有抑制炎症级联反应和细胞增殖的作用。