Par3、p-JAK、p-STAT3蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达及病理特点分析①

郭春凤，黄修菊，马俊旗

(新疆医科大学第一附属医院妇科，乌鲁木齐830054)

宫颈鳞癌在女性恶性肿瘤死亡病因列居第二位，中晚期和复发患者预后不良[1]。上皮性肿瘤的发生及侵袭转移中，极性蛋白复合物par3-par6-apKC起着至关重要的作用，par3(partitioning defective protein 3)是复合物中最为关键的组分。乳腺癌、甲状腺癌和直肠癌中par3蛋白低表达，与肿瘤低分化、转移及总生存期相关[2-4]。肝细胞癌和肾透明细胞癌中par3蛋白表达高于正常组织，与患者低生存率呈正相关[5-6]。正常宫颈组织仅表达非磷酸化的酪氨酸激酶(Janus kinase 2，JAK2)和信号转导子和转录激活子3(signal transduction and activators of transcription，STAT3)，而宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous carcinoma，CSCC）组织中p-JAK和p-STAT 3持续阳性表达[7-8]。本文通过测定par3、p-JAK和p-STAT3蛋白在慢性宫颈炎(chronic cervicitis，CC)、宫颈上皮内瘤变(cervical icalintfaepithelial neoplasia II-III，CIN IIIII)、CSCC等组织表达，分析宫颈鳞癌病理参数特征，初探三者与宫颈鳞癌的关系。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取新疆医科大学第一附属医院2016年1月－2017年12月CC、CIN II-III和CSCC患者的石蜡包埋组织标本，共93例。其中CC14例，CINII-III36例，CSCC 43例(临床分期：≤IB16例，＞IIA27例；肿瘤组织学分化：高分化7例，中低分化36例。另纳入CSCC中7例阳性淋巴结组织标本。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：病理组织活检证实为CSCC、CINⅡ-Ⅲ以及CC者。排除标准：⑴罹患其他系统恶性肿瘤者；⑵尚在妊娠期或哺乳期；⑶CSCC诊断有争议不确定者；⑷曾行放疗、化疗等治疗的CSCC者；⑸临床资料缺失者。本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审批通过。

1.3 抗体和试剂 SP试剂盒（SP-9001）和DAB显色剂（ZLI-9018）均购自北京中杉金桥公司。鼠抗人pard3抗体、兔抗人p-JAK单抗、兔抗人p-STAT3单抗(均1:300稀释，Santa Cruz公司)。

1.4 方法

1.4.1 par3、p-JAK和p-STAT 3蛋白检测 应用免疫组化SP法，切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，微波炉抗原修复。加入适量H2O2可以阻断内源性过氧化物酶，再滴加一抗后放置4℃冰箱过夜(PBS作为阴性对照)。次日加入二抗，DAB显色后用苏木素复染、常规脱水后透明封片。

1.4.2 结果判断 两名副主任医师以上职称者判读结果。光学显微镜下（×200）计数阳性细胞数与上皮细胞占比。综合积分公式=(染色细胞分数+染色强度分数)／2。综合判定：积分小于0.5分则为表达缺失，0.5～1.5分者视为表达下调，积分大于1.6分则为正常表达[9]。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析，资料分析采用χ2检验和Fisher精确概率法。应用Pearson相关做相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 par 3、p-JAK和p-STAT3蛋白在CC、CIN IIIII、CSCC以及转移淋巴结组织中的表达 par3蛋白阳性表达位于细胞质，染色呈黄棕色（见图1）。par3在CSCC中的阳性表达率低于CC和CIN（P＜0.05）（见表1）。细胞质和细胞核是p-JAK和p-STAT3主要表达部位。p-JAK在CSCC中的阳性表达率高于CC，低于CIN（P＜0.05），p-STAT3在CSCC中的阳性表达率高于CC（P＜0.05）（见表1）。

注：a1-a3、b1-b3、c1-c3分别表示par3、p-JAK、p-STAT3蛋白在CC、CINII-III和CSCC中的表达。

表1 par 3、p-JAK和p-STAT3蛋白在CC、CIN、CSCC以及转移淋巴结组织中的表达[例（%）]

2.2 par 3、p-STAT3和p-JAK蛋白在CSCC组织中的阳性表达及与临床病理参数的关系 par3的阳性表达率与宫颈鳞癌的组织学分化、淋巴结转移具有相关性（P＜0.05）。p-JAK、p-STAT3阳性表达与肿瘤临床分期、组织学分化有关（P＜0.05）（见表2）。

表2 par 3、p-STAT3和p-JAK蛋白在CSCC组织中的阳性表达及临床病理参数的关系

2.3CINII-III及CSCC组织中par 3、p-JAK和p-STAT3蛋白表达水平相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，CINII-III组织中par3与p-JAK、p-STAT3蛋白之间的表达呈负相关（r=－5.553和－6.092，P均＜0.05）。CSCC组织中par3与p-JAK和p-STAT3表达无相关性（r=0.281和2.118，P均＞0.05）见表3。

表3 CINII-III、CSCC组织中par3、p-JAK及p-STAT3蛋白表达水平的相关性分析

3 讨论

par3-par6-a pKC聚合体最关键的组份是par3，其细胞定位在哺乳动物上皮细胞顶端侧膜上，功能是维持上皮细胞的紧密连接(tight junction，TJ)。TJ形成最初，par3承“锚定蛋白”的角色，吸引par6、ap-KC蛋白正确定位，一旦par3蛋白过表达或是表达缺失，par6、apKC和TJ蛋白定位即出现错误。par3的骨架作用破坏，细胞失去极性诱发肿瘤细胞侵袭迁移[10-11]。Janus蛋白酪氨酸激酶(Janus activated kinase，JAK)-信号传导及转录激活因子(signal transduction and activators of transcription，STAT)信号途径是重要的传导途径之一，受体被激活后与DNA片段结合发挥调控下游基因功能。生理情况下组织中STATs的激活很短暂，但肿瘤细胞中STATs呈持续活化，下游基因表达异常，诱导细胞异常增殖而致肿瘤侵袭转移[12]。

par3与细胞极性及上皮肿瘤发生发展机制是目前研究热点。Iden等[13]研究发现par3在小鼠和人类的角化棘皮组织中均低表达，提示par3具有抑癌特性。两项有关前列腺癌的研究显示[14-15]，下调par3的表达可抑制体外前列腺癌细胞的迁移、侵袭；对肿瘤的发生、远处转移和复发也有一定程度控制；当par3过表达时实验结论也相悖。故推测par3高表达，肾脏脑蛋白（Recombinant Kidney And Brain Protein，KIBRA）螯合介导Hippo通路失活后，促转移基因表达上调，诱导肿瘤转移。与此相反，下调par3表达激活Hippo通路，抑制Yes相关蛋白(YAp)的核转运，亦成为潜在的前列腺癌转移治疗途径。Zheng等[16]研究显示，par3的低表达与CSCC肿瘤分期、组织学分级、淋巴结累及相关，与本研究结果一致。本研究中，7例转移淋巴结组织中par3蛋白表达缺失，par3蛋白低表达或表达缺失与淋巴结转移有关。

Mc Caffrey等[17]通过小鼠模型发现par3缺失与MMP9诱导的细胞外基质的破坏和侵袭有关，并且par3缺失可促进非典型蛋白激酶C（Atypical protein kinase C，apKC）活化JAK2/STAT3。Lin等[18]体外培养A549细胞发现转染靶向STAT3的siRNA、STAT3和p-STAT3阳性表达率也下降，肺癌细胞的增殖也被抑制。因此通过检测p-JAK、p-STAT3可判断JAK2/STAT3的活化状态。侯大乔等[19]模拟阻断JAK2/STAT3信号通路，测定p-JAk、p-STAT3的表达，发现p-JAk、p-STAT3、MMp-2和Vegf的表达均较前显著下调，且Hela细胞增殖受抑制，细胞凋亡增加。

Zhang等[20]的研究发现E6蛋白调控的STAT3-microRNA-223-3p(miR-223)-TGFBR3/HMGCS1轴控制子宫颈癌的发生。miR-223在宫颈肿瘤组织中高表达，miR-223的表达增加是由转录因子STAT3介导的，其活性通过E6在白细胞介素(IL)-6刺激下增强。此外，来自CSCC细胞的外泌体miR-223在体外共培养系统中诱导单核/巨噬细胞分泌IL-6，而IL-6的分泌反过来导致CSCC细胞中STAT3活性增强，形成正反馈回路。STAT3-miR-223-HMGCS1/TGFBR3轴在宫颈癌进展过程中发挥关键信号通路的作用，为开发基于STAT3治疗人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)阳性宫颈鳞癌提供了强有力的理论依据。

本研究结果显示，相比CC，p-JAK、p-STAT3在CINII-III和CSCC中高表达（P＜0.05），p-JAK蛋白在阳性淋巴结组织中表达率为100%。说明p-JAK和p-STAT3蛋白高表达与宫颈组织病变、宫颈鳞癌的发生密切相关。且与宫颈鳞癌临床分期及组织分化具有相关性。CIN II-III中，par3与p-JAK、p-STAT3的表达均呈负相关，推测par3蛋白低表达，促进JAK2/STAT3信号通道异常活化，诱发宫颈上皮内瘤变甚至肿瘤发生，其机制尚需进一步探讨。