牛膝防治慢性牙周炎机制的网络药理学研究①

赵 今，吴泽钰，龚 怡，王 琛

（1新疆医科大学第一附属医院/附属口腔医院牙体牙髓科，2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，乌鲁木齐830054）

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是牙菌斑与宿主免疫反应共同相互作用后，发生的一类炎症性疾病。这种炎症可以破坏牙周支持组织，进而形成牙周袋和牙槽骨吸收，最终导致牙齿松动脱落[1]。现代医学中，慢性牙周炎的治疗有时会使用抗生素作为辅助用药，以缓解机械治疗不能到达的炎症部位[2]。但是抗生素的一些副作用减少了使用频率，而中医以其良好的治疗作用在许多国家引起了广泛的关注和接受。牛膝为苋科牛膝属植物（Achyranthis Bidentatae Radix）之干燥根，牛膝的用药历史悠久，药源广泛，具有很大的开发潜力[3]。在很多治疗骨质疏松的方剂中，牛膝是一味主要用药。现代药理学研究发现，牛膝具有抗炎、抗衰老及增强免疫力等作用[4]。天然药物中通常含有许多活性成分，一般可作用于多个靶点，这与网络药理学的思想有很大相似之处。本研究通过网络药理学方法研究牛膝提取物在治疗CP的活性成分，及分析其潜在分子机制和药理活性。

1 材料与方法

1.1筛选牛膝中活性成分及预测靶点 使用中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）筛选并整理牛膝化学成分及靶点。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物类药性（drug likeness，DL）≥0.18为筛选条件，筛选出牛膝中的活性成分及作用靶点。

1.2 筛选CP靶点 以词"chronic periodontitis，periodontitis"为关键词，在Genecards、DrugBank、OMIM数据库检索，可获得CP靶点。与牛膝所筛选出的作用靶点进行韦恩分析，得到牛膝治疗CP的作用靶点。

1.3构建“成分-靶点”网络 将牛膝的化学成分及所筛选出的交集靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，进行“成分-靶点”网络图的构建，Network Analyzer计算网络拓扑参数，度值（degree）、中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和拓扑系数（topological coefficient）。

1.4构建蛋白相互作用（PPI）网络 所得的交集靶点导入STRING 11.0数据库，设置“homo sapiens”属性，置信度得分＞0.4，利用Network Analyzer分析拓扑属性，构建PPI网络图。

1.5基因本体（gene ontology,GO）和京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析 利用Cluster Profiler软件包对获得的靶点进行GO富集分析及KEGG富集分析绘图，筛选生物途径和分子功能筛选错误率(false discovery rate，FDR)＜0.001，P＜0.001，筛选有显著性差异的生物过程和信号通路。

1.6通路-CP靶点-牛膝活性成分网络构建 将通路、靶点和成分导入Cytoscape3.7.2中，利用的“Merge”功能合并，构建“通路-靶点-成分”网络。

2 结果

2.1牛膝活性成分筛选 通过TCMSP数据库及药代动力学（ADME）参数筛选出牛膝的活性成分20个，见表1。

表1 牛膝主要活性成分及参数

2.2 牛膝与CP的共同靶点 检索得到CP相关的疾病靶点4 543个，去除重复后得2 132个。检索得到牛膝作用靶点826个，去除重复后得457个。韦恩分析二者交集靶点（图1），获得牛膝与CP共有靶点183个，其中包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素-10（Interleukin 10，IL-10）、白介素-6（Interleukin 6，IL-6）等，见表2。

2.3“成分-靶点”网络 网络拓扑学结构分析显示，化合物的平均度数为5.9，其中度数较大（度数＞10）的化合物为槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、山奈酚、黄芩苷、豆甾醇、β谷甾醇、小檗碱、刺苷A、黄连碱、表小檗碱、巴马汀。牛膝中各成分作用于多种靶点，多条线互相交织。根据获得的交集靶点，对应到牛膝中18个主要成分，共含248个节点，1 738条边缘，并根据网络拓扑学结构中的度值从大到小依次进行排列，见图2、表3。

图1牛膝与CP的Venn图

2.4 PPI网络分析 将183个交集靶点导入STRING数据库，进行网络拓扑学分析，得到PPI网络（图3A）。根据度值大小筛选出前30位的靶点（图3B），其中前10位分别为是AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、TP53、EGFR、PTGS2、CASP3、JUN、MAPK1（表4）。

表2牛膝治疗CP的成分作用靶点信息

图2 牛膝-成分-靶点-牙周炎网络关系

表3 牛膝活性成分的拓扑学参数分析

图3牛膝化学成分治疗CP靶点-蛋白相互作用

2.5 GO和KEGG富集分析 对上述183个交集靶点进行GO富集分析，设置阈值P＜0.01，生物过程(biological process，BP)相关条目880个，涉及抑菌活性、细胞对有机环化合物的反应等方面；分子功能(molecular function，MF)相关条目49个，涉及DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合等方面；细胞成分(cellular component，CC)相关条目23个，涉及膜筏、膜区等方面。BP、MF、CC功能分别GO富集分析出的前5条条目信息见表5。MF、CC、CC功能GO富集分析结果见图4～6。KEGG分析得到265条信号通路，根据P值筛选出101条通路。其中信号通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路等；疾病通路有癌症通路、流体剪应力与动脉粥样硬化、乙肝、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等通路。见图7、表5。

表4牛膝治疗CP核心蛋白互作的拓扑学参数

表5牛膝治疗CP的潜在靶点GO富集分析结果（各前5条）

图4 MF功能GO富集分析结果

图5 CC功能GO富集分析结果

图6 BP功能GO富集分析结果

图7牛膝治疗CP的潜在靶点的KEGG富集分析

表5牛膝治疗CP的潜在靶点KEGG富集分析（前10条）

2.6 牛膝活性成分-核心CP靶点-代谢通路网络“通路-靶点-牛膝成分”网络可见45个信号通路、183个核心靶点、18个药物成分间关系密切，见图8。提示，牛膝中的多种活性成分可能通过调节多条信号通路以调节慢性牙周炎的炎症、成骨等过程。

图8 牛膝活性成分-核心靶点-通路网络

3 讨论

CP是口腔疾病中常见疾病，临床表现常以牙龈肿胀，牙槽骨吸收最终牙齿松动脱落为主要发展过程，这已成为人类失牙的主要原因之一。有效的牙周治疗仍是一个长期的难题，牙周治疗的目标以消除牙周病的感染和炎症过程为主[5]。研究发现，中医药可通过药物配伍控制菌斑、杀灭微生物、促组织再生、消炎等治疗牙周炎[6]。

牛膝是我国的一味传统中药，历史非常悠久，最早记载于《神农本草经》，因为形状似牛膝而得名。本研究得出牛膝在治疗CP时含有18种有效成分。其中黄芩苷是牛膝中的主要成分之一，黄芩苷治疗牙周疾病的过程中，在抑菌和抗炎中发挥了很好的效果[7]。牛膝中的蜕皮甾酮经过细胞实验证实能够显著促进成骨细胞的增殖以及分化，牛膝甾酮能够显著上调成骨分化相关标志物，最终促进成骨细胞的早期分化和晚期矿化能力[8]。近年来的研究表明，牛膝中的成分不仅能抑制小鼠耳廓肿胀，而且也能抑制毛细血管的通透性增加[9]，抵抗炎症反应。其抗炎机制可能与抑制活化巨噬细胞炎性因子TNF-α，IL1β的释放有关[10]。根据PPI网络分析，与牛膝治疗CP有关的前10位靶点分别是AKT1、IL6、TNF、VEGFA等。其中AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，被PI3K激活并募集到质膜上，在调节细胞生长和凋亡方面起着重要作用[11]。而TNF-α能够增加破骨细胞前体细胞数量、诱导骨髓中巨噬细胞的破骨分化及破骨细胞成熟从而促进骨吸收[12]，IL-6不仅可以促进成骨细胞活化并产生破骨细胞分化因子，进一步加速破骨细胞形成[13]，而且还参与牙周炎的炎症过程，其浓度的变化与牙周炎的炎症程度相关，并抑制牙周膜的再生[14]。VEGFA是血管发育中最重要的生长因子，它促进骨祖细胞分化，还可以促进骨相关细胞因子如胶原、相关转录因子2（Runx2）、转化生长因子(TGF)和碱性磷酸酶(ALP)的分泌[15]。

本研究对牛膝治疗CP所富集到的183个靶点进行GO和KEGG信号通路分析，涉及到抑菌活性、创伤愈合、细胞迁移的正调控等952个GO条目。已有研究证明槲皮素对牙龈假单胞菌的各种毒力因子均有很好的抑制作用[16]。牙周组织的再生依赖于有效和平稳的伤口愈合过程，而创伤愈合过程在很大程度上取决于血管生成[17]。研究发现牛膝提取物主要通过促进细胞迁移来促进体外培养的人脐静脉内皮细胞和体内斑马鱼的血管生成，也可加速成纤维细胞由G0/G1期进入S期，促进成纤维细胞的增殖，从而促进创面愈合[18]。这体现了牛膝治疗CP多成分、多靶点的作用特点。KEGG富集分析得到与牛膝治疗CP相关的信号通路有101条，其中涉及了糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路等。AGEs通过RAGE、MAPK和NF-κB途径增加IL-6和ICAM-1的表达，可能加重牙周病发病的进程[19]。此外，Lin等[20]的研究发现，IL-17刺激健康人牙周膜细胞后，p38、ERK1/2和JNK磷酸化水平均明显增强。实验证明，牛膝提取物中的黄芩苷可降低ERK、p38、JNK等蛋白的磷酸化，进一步抑制炎症因子的产生和细胞凋亡，在牙周炎的发生发展中起到重要作用[21]。

本研究通过网络药理学的方法，阐述了牛膝中的主要成分、潜在治疗CP的靶点、作用途径及可能的机制。探究了牛膝治疗CP具有多成分、多靶点、多途径的特点，为今后牛膝在治疗CP中的应用提供了理论依据，具体作用机制还需进一步实验进行验证。