负载人工抗原递呈细胞的Fe3O4磁性碳纳米粒子对滋养细胞凋亡、侵袭及黏附能力的影响①

贺红梅,邵长好,陆春燕,才秋敏

（秦皇岛市妇幼保健院病理科，河北秦皇岛066001）

原因不明复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）是指与同一性伴侣发生≥2次自然流产，且无解剖、内分泌、染色体、生殖道感染及自身免疫功能异常等病因[1]。已有研究显示，正常胚胎被母体接纳有赖于母-胎界面的妊娠免疫耐受，一旦该种耐受格局被打破，将导致URSA[2]。目前USRA以淋巴细胞主动免疫治疗、普通免疫抑制剂治疗为主，但成本高、操作复杂、毒副作用严重[3]。近年随着分子生物学的深入，已有研究发现，URSA患者绒毛组织中可见特征性的滋养细胞凋亡，且凋亡率相较于正常妊娠患者绒毛组织更高，提示滋养细胞过度凋亡可能是URSA发病原因之一[4]。滋养细胞的增殖、侵袭和黏附功能对于正常妊娠起着重要作用，若滋养细胞的大量凋亡则可导致其侵袭和黏附功能减弱，影响胎盘生长、成熟及功能，从而出现URSA等不良妊娠结局[5]。因此，探究诱导妊娠免疫耐受的有效方式，在治疗USRA上应用前景广阔。磁性Fe3O4具有优良的磁学性能，可结合纳米载药系统进行靶向药物输送及蛋白磁性分离，在基因治疗中可提高靶细胞的转染效率[6]。碳是一种理想的磁性纳米颗粒包覆材料，具有密度小，表面积大，稳定性高等特点。复合空心碳材料与磁性Fe3O4有助于提高生物体和磁性金属间的相容性，具有广阔的医学应用前景[7]。本研究旨在寻求一种综合的生物学方法来诱导母胎免疫耐受状态，采用生物学手段联合材料学前沿技术复合空心碳材料与磁性Fe3O4，同时负载人工抗原递呈细胞（artificial antigen presenting cells，aAPC）行生物靶向治疗，研究其对滋养细胞凋亡、侵袭、黏附的影响。

1 材料与方法

1.1材料 正常早孕流产妇女（孕7～9周）的绒毛，URSA患者外周血16 mL左右，均在患者同意且签署知情同意书后获取;aAPC购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂和仪器 直标鼠抗人CK7-FITC单克隆抗体、CD3-FITC抗体（美国Thermo Fisher Scientific公司），Anexin V-FITC染液、PI染液（北京中山金桥生物技术有限公司）;二甲基噻唑（dimethylthiazole，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（上海源叶生物科技有限公司）。Transwell小室（北京优尼康生物科技有限公司），FACSCanto II流式细胞仪（美国BD公司），MPR-A100酶标仪（日本ASONE株式会社）。

1.3 方法

1.3.1 绒毛膜滋养细胞分离和鉴定 取正常早孕流产妇女的绒毛，用改良密度梯度离心法分离、培养原代胎盘滋养细胞[8]。培养72 h后，取500µL新鲜分离细胞悬液，固定并破膜后，加直标鼠抗人CK7-FITC单克隆抗体及山羊抗鼠IgG，各2µL，充分振荡，4℃孵育20 min，流式细胞仪鉴定细胞纯度。

1.3.2 CD3+T细胞分离和鉴定（1）与磁化aAPC结合的CD3+T细胞分离:合成直径分布在1～10µm、表面光滑的碳空心球，依次进行水解和热处理，合成碳空心球包覆Fe3O4纳米颗粒的复合粉末。以抗CD3和抗CD28mAb包被Fe3O4磁性碳纳米粒子形成磁化aAPC。采集URSA患者外周血8 mL，分离血浆，将磁化aAPC与血浆混合，从磁选柱中流过，与磁化aAPC结合的CD3+T细胞会附着在磁选柱一侧并被冲洗到液体培养基中进行生长和分裂。（2）CD3+T细胞分离:采用免疫磁珠分选技术分离CD3+T细胞。采集URSA患者外周血8 mL，分离外周血单个核细胞，调整细胞密度至1.0×107个/mL，加入20µL CD3磁珠，4℃避光孵育20 min，细胞悬浮、离心后弃上清，培养基500µL悬浮细胞，悬浮液过CD3+T细胞富集柱后经培养基500µL洗涤3次，转移至细胞收集试管中，添加培养基1 mL至柱中，活塞冲洗柱子，收集CD3+T细胞。（3）CD3+T细胞鉴定:调整细胞密度至1.0×106个/mL，取20µL CD3-FITC抗体，混合均匀后遮光孵育15 min，PBS震荡后洗涤、离心，弃上清，加入500µL PBS悬浮细胞，流式细胞仪鉴定纯度。

1.3.3与磁化aAPC结合的CD3+T细胞、滋养细胞共培养及分组 取6.4 mm膜直径、8µm孔径、24孔板细胞迁移（Transwell）小室，冰浴融化基底膜（Matrigel）胶，PBS稀释为1 mg/mL，50µL/孔预先铺设于Transwell小室上室滤膜上。下室中加入600µL密度为1.0×106个/mL与磁化aAPC结合的CD3+T细胞，培养基培养24 h后用于后续实验。与磁化aAPC结合的CD3+T细胞、滋养细胞，CD3+T细胞、滋养细胞共培养体系分别设置为A组、B组，每组设置5个复孔。Transwell小室下室中加入100µL密度为1.0×106个/mL与磁化aAPC结合的CD3+T细胞或培养基孵育，上室中加入100µL密度为1.0×106个/mL滋养细胞培养基。将单独滋养细胞培养体系设置为C组，设置5个复孔。Transwell小室下室中加入培养基孵育，上室中加入100µL密度为1.0×106个/mL滋养细胞培养基。各共培养体系均于37℃孵育24 h，取各组上室细胞行后续实验[9]。

1.3.4 AnnexinV-FITC/PI染色法测定各组凋亡情况取各组细胞制成单个细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/mL。取1 mL细胞以2 800 r/min离心10 min，用PBS吹打15次重悬后再次离心10 min，弃上清液。用冷PBS洗涤2次，在细胞悬浮液中加入5µL Anexin V-FITC，混匀并置于2～8℃避光条件下孵育15 min后，加入5µL PI染液，混均并在2-8℃避光条件孵育5 min后，加入binding buffer标记液100µL洗涤2次。在制备完成的60 min内使用流式细胞仪测定细胞凋亡率，Cell Quest软件分析、计算数据。实验重复3次取平均值。

1.3.5 Transwell小室实验测定各组侵袭能力 冰浴融化Matrigel胶，PBS稀释为1 mg/mL，50µL/孔预先铺设于Transwell小室滤膜上，上室中加入密度为5.0×105个/mL的各组细胞，下室中加入200µL培养基。常规培养48 h至Matrigel胶被降解，PBS冲洗后0.25%戊二醛固定，30 min后0.1%结晶紫染色，洗涤、晾干。随机选取滤膜中央及周围共5个视野，计算穿过微孔细胞数/视野。实验重复3次取平均值。

1.3.6 黏附实验测定各组黏附能力 以无血清培养基RPMI-1640配置人工Matrigel胶（0.04µg/mL），预先铺设于96孔板（2µg/孔），超净台中风干24 h至凝固。取各组细胞，调整密度为1.0×105个/mL，将细胞悬液加入96孔板（200µL/孔），培养基中培养6 h后取出孔板，弃培养液，PBS清洗，加入培养基（200µL/孔）和新制备MTT溶液（5 mg/mL，20µL/孔），培养箱中继续培养4 h，吸干剩余培养基后加入DMSO溶液（150µL/孔），震荡15 min使结晶溶解，酶标仪检测490 nm吸光度值，以吸光度值表示黏附能力。实验重复3次取平均值。

1.4 统计学分析 应用SPSS19.0分析数据，计量资料用t检验，以均数±标准差（±s）表示，多样本资料比较用单因素方差分析，如Levene检验方差齐，用单因素方差分析，再用LSD-t两两比较，如Levene检验方差不齐，改用welch检验，再用Dunnett T3检验两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1滋养细胞纯度鉴定 经流式细胞仪检测，细胞表面CK7阳性细胞构成比为97.50%，见图1。

图1 滋养细胞表面特异性标志物表达情况

2.2 CD3+T细胞纯度鉴定 经流式细胞仪检测，与磁化aAPC结合的CD3+T细胞、CD3+T细胞表面CD3阳性细胞构成比分别为95.90%、97.54%，见图2。

2.3 各组滋养细胞凋亡率比较 与A组滋养细胞凋亡率[（5.68±0.74）%]比较，B组[（13.64±2.05）%]、C组[（29.90±4.78）%]滋养细胞凋亡率均升高（P均＜0.05）;与B组[（13.64±2.05）%]比较，C组[（29.90±4.78）%]滋养细胞凋亡率升高（P＜0.05），见图3。

图2 CD3+T细胞表面特异性标志物表达情况

图3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

2.4各组滋养细胞侵袭能力比较 与A组[（195.20±24.13）个]滋养细胞穿过微孔细胞数/视野比较，B组[（102.00±15.47）个]、C组[（45.40±8.56）个]滋养细胞穿过微孔细胞数/视野减少（P＜0.05）;与B组[（102.00±15.47）个]比较，C组[（45.40±8.56）个]滋养细胞穿过微孔细胞数/视野减少（P＜0.05），见图4。

图4 各组微孔细胞数比较（×400）

2.5 各组滋养细胞黏附能力比较 与A组（0.74±0.13）滋养细胞光密度值比较，B组（0.48±0.09）、C组（0.29±0.05）滋养细胞光密度值光密度值减小（P＜0.05）;与B组（0.48±0.09）比较，C组（0.29±0.05）滋养细胞光密度值光密度值减小（P＜0.05）。

3 讨论

妊娠免疫耐受是正常妊娠时母体一种特殊的外周免疫耐受，保护作为半同种移植物的胎儿不被母体免疫系统排斥，从而成功妊娠[10]。当该种免疫耐受状态失衡时，将诱发一系列病理妊娠如URSA的发生。滋养细胞侵袭、黏附及免疫细胞活化、游走等行为在诱导妊娠免疫耐受中起到重要作用，且滋养细胞存在于与母体免疫系统直接接触的胚胎性组织中，通过接触蜕膜、释放细胞因子等方式调控母体蜕膜免疫活性细胞，被认为是妊娠耐受的始动细胞，其侵袭、黏附能力降低，凋亡增加与URSA的发生关系密切，改善其生物学行为也是治疗该病的主要思路[11-12]。

抗原递呈细胞提供的双重刺激信号是CD3+T细胞活化、增殖及分化为效应细胞的重要基础，aAPC是在磁珠、胶乳微球、脂质体等人工载体表面交联抗CD、CD28单克隆抗体或主要组织相容性复合体[13]。随着新兴技术的发展，aAPC在制备、应用、效果评价等方面渐趋完善与成熟。与自身APC存在的缺点如自体分离培养困难，T细胞活化增殖周期较长、活化条件不易控制相比，aAPC具有培养较易、T细胞活化增殖周期较短、活化条件可控等优点[14]。由于aAPC存在的优势，其在临床免疫治疗和基础免疫治疗中具有前瞻性意义。因此，本实验通过现代生物学手段，与材料学前沿技术联合，探寻合适的aAPC载体，进一步探究生物学靶向治疗URSA的可行性，有望为该病免疫治疗带来新的突破。Fe3O4磁性纳米碳粒子是一种重要的复合过渡金属氧化物超微颗粒，具有生物相容性良好、比表面积大、无毒性、高饱和磁化强度等诸多优势[15]。目前尚未发现其对肾、胃肠道和骨髓的毒副作用，糖类、脂类代谢异常或过度免疫现象，亦未增加发生肿瘤的可能性等不良反应，安全性较高[16-17]。Fe3O4磁性纳米碳粒子在生物医学中的应用日益增多，目前主要应用于靶向定位给药、细胞标记、细胞和组织定位、转染、免疫分析及核磁共振成像等生物医学领域[18]。淋巴系统作为机体的免疫系统，对于机体抵御外来侵害具有重要作用。纳米粒子具有淋巴靶向性，易在淋巴系统分布和存留，能够影响固有免疫细胞的活性及免疫系统免疫分子的分泌。因此，研究纳米粒子对免疫系统的影响具有重要意义。Hou等[19]研究发现，静脉注射Fe3O4磁性纳米粒子能够以剂量依赖的方式影响正常ICR小鼠的免疫功能。低剂量组Fe3O4纳米粒子淋巴细胞增殖率高于对照组，而生理盐水和高剂量组的淋巴细胞增殖与对照组相比却较低。在外周血中，低剂量组的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的比例要高于对照组。此外，Fe3O4纳米复合材料还能够作为抗肿瘤药或疫苗载体，Cao等[20]采用溶剂蒸发技术、响应表面法对雷帕霉素负载的中空磁性Fe3O4纳米复合材料进行开发、优化，可显著提升雷帕霉素杀死肝癌细胞的能力，且表现出浓度依赖性，暗示中空磁性Fe3O4纳米复合材料作为载体的潜在价值。本研究将改造后的aAPC负载至制备完善的磁性Fe3O4纳米碳颗粒上，再利用外加磁场分离URSA患者外周血CD3+T细胞，结果显示C组、B组、A组滋养细胞凋亡率依次降低，滋养细胞穿过微孔细胞数/视野依次增加，光密度值依次增大，提示与磁化aAPC结合的CD3+T细胞可促进滋养细胞侵袭及黏附能力的增强，减少其凋亡，验证磁化aAPC诱导妊娠免疫耐受的能力。目前针对URSA的主动免疫治疗途径以皮内注射为主，免疫原可采用丈夫或无关个体的淋巴细胞、单个核细胞或合体滋养细胞膜等，其中最常用的是淋巴细胞。然而URSA可依赖的免疫学检查较为有限，暂无特异的免疫学指标对治疗前后的免疫状态进行监测和指导[21]。已有研究发现，在体外实验中根据实验方法和样品类型不同，1%～10%的T细胞群体可能存在同种异体反应性，可使用混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR）对体外实验中同种异体细胞排斥反应进行监测[22]。然而，本研究由于人员和经费限制，未进行MLR监测，这可能对实验结果造成一定影响，在未来的进一步研究中将予以完善。

综上所述，与磁化aAPC结合的CD3+T细胞可增强滋养细胞侵袭及黏附能力，减少其凋亡，为URSA的治疗提供新的可能。