超声辅助提取微藻油脂机理及工艺参数的研究∗

张仕双 李彬彬 傅波

(四川大学机械工程学院 成都 610065)

0 引言

受化石能源的不可再生性、日益减少的存储量以及对环境的污染等影响，可再生能源引起世界各国的广泛关注[1]。生物质能源是人类应对能源危机和环境恶化时提出的解决方案之一。其中生物柴油是将生物体内的油脂经酯交换反应而形成以脂肪酸甲酯为主要成分的一种生物质液体燃料，是近年来生物质能源研究的热点。在制备生物柴油的众多原料中，微藻凭借油脂含量高、生长速度快、培养不占用耕地等优点被认为是生物质能源的重要原料[2−3]。

在微藻的能源转化过程中，将微藻植物油经酯交换反应制得生物柴油的技术已经成熟；但是，由于微藻细胞壁比较坚固，微藻中油脂的提取仍然面临巨大的挑战[4]。超声波破碎法是一种有效的细胞破碎方法，广泛应用于油脂浸取、多糖提取以及天然药物活性成分提取[5]。郭孝武等[6]介绍了利用超声提取分离技术在苹果、红花、橘皮、小球藻等植物中提取油脂的应用以及相关工艺参数。Araujo等[7]设置不同实验组，研究超声对微藻油脂提取的影响，结果表明超声波处理能有助于细胞壁破碎，提高了提取效率。Santos等[8]通过实验对几种小球藻油脂的提取方法进行比较，结果表明在超声波辅助作用下，利用有机溶剂氯仿:甲醇(2:1)的混合物作为溶剂是从微藻类中提取脂类物质最有效的方法。Ellison等[9]介绍了一种对微藻类进行处理的新技术路线，研究了超声功率和处理时间对微藻油脂提取的影响，结果发现超声功率越高，处理时间越长，细胞破碎越彻底，油脂产量越高。岳敏等[10]研究了超声功率、超声处理温度以及时间等因素对细胞破壁率的影响，得出一组优化的超声破壁参数。

现有研究主要是采用固定的超声设备进行实验，研究超声电功率、时间以及萃取试剂等因素对提取率的影响，而对超声辅助提取微藻油脂的机理、超声振动子的结构设计以及超声频率、超声振动子工具头浸入溶液深度等工艺参数如何影响微藻细胞破碎率等方面较少涉及。本文分析了超声波对微藻细胞的作用机理，建立了基于声冲流、声辐射力、声空化的传质动力学的经验模型，设计了几种常见纵振频率的超声振动子，研究超声频率、超声电功率、工具头浸入溶液深度、超声处理时间、萃取试剂等因素对微藻细胞破碎率的影响，获取超声提取微藻油脂的最佳工艺参数。

1 超声辅助提取微藻油脂机理

超声振动子将电能转变为超声振动，在溶液中形成声冲流、声辐射力以及声空化效应[11]。声空化效应形成的空化泡在振荡或破裂的过程中会在局部产生瞬时的高温、高压，同时产生强烈冲击波和剪切力，对周围的细胞有冲击撕裂的效果，破坏生物细胞壁和细胞膜，有利于细胞内容物释放到提取液中[12]。高频振动产生的声冲流与声辐射力在提取液中产生的冲流、涡流以及湍流促进微藻细胞与溶剂形成对流，具有搅拌作用，加快提取进程。

微藻油脂的物理提取是有效成分从固相向液相传递的动力学过程，其实质是传质动力学理论。Fick第一定律表达式为

式(1)中，D表示扩散系数，S表示扩散面的面积，c表示扩散物质的体积浓度，dc/dx表示溶质浓度梯度，“−”号表示扩散方向与浓度梯度的方向相反，dn/dt表示溶质扩散速率。

微藻细胞中溶质的浓度随着时间的增加而不断下降的同时，扩散边界层的浓度也随时间减小，其变化曲线可用幂函数表示：

在超声振动提取时，扩散系数D由两种扩散系数组成，分别为分子扩散系数DM和涡流扩散系数DE[13]：

其中，

式(4)中，K表示影响系数，E表示扩散活化能，R表示普适气体常量，T表示温度，q表示浓度的参数。

考虑到声空化、声冲流、声辐射力所产生的微射流、涡流以及湍流现象，对涡流扩散系数DE进行定义：

式(5)中，vs表示由声冲流引起的涡流速度，vf表示由声辐射引起的振动速度，vc表示声空化引起的射流速度；k1、k2、k3、k4分别表示声冲流系数、声辐射振动系数、声空化系数以及各因素之间的相互影响系数。

将式(4)、式(5)带入式(3)可得

超声作用于溶液，溶液中物质破碎产生的附加表面积能提高传质率[14]。超声振动将细胞壁破碎，增大细胞中的溶质与溶液的接触面积，根据文献[15]研究结果对扩散面的面积S进行修正：

式(7)中，S0表示超声作用前的扩散面积，t表示时间，µ表示与微藻颗粒形状相关的系数，P表示超声功率。

微藻细胞的总数为ω，其颗粒线度为σ，总质量为G，其密度为ρ，可得

其中，k、k′是与细胞形状和线度有关的常数，化简后得

式(11)中，Y表示细胞吸收溶剂的速率，对于特定的细胞Y是一定值。

将式(2)、式(6)、式(7)、式(8)、式(11)、式(12)代入式(1)，结合边界条件：在t=0时，c=0；在t≠时，n=Vc，n表示溶质物质的量，V表示溶液体积。进行积分化简得到超声微藻油脂提取的传质动力学方程：

以上方程表明，扩散物质的体积浓度受超声电功率、作用时间等工艺参数的影响，为了提高微藻细胞的破碎率及油脂的提取率，需选取恰当的超声辅助工艺参数。

2 超声振动子的设计

超声振动子主要由换能器、变幅杆和工具头组成，结构示意图如图1所示。在工作区内要破坏微藻细胞壁，纵向振动的振幅应不低于25µm，换能器的纵振频率应在20 kHz以上[16]。因此，本文设计常见的共振频率20 kHz、25 kHz、28 kHz振动子。

图1 超声振动子结构示意图Fig.1 Schematic diagram of ultrasonic vibrator structure

传输矩阵法作为一种压电超声振动子的设计建模方法，因其简明有效的特性被许多研究采用[17]。将超声振动子等效成多个单一截面杆的串联，对各个单一截面杆建立四端网络，得到若干个传输矩阵，忽略机械损耗及预应力螺栓的影响，最后再将所有的四端网络串联起来，即可得到超声振动子整体的传输矩阵方程[18−19]：

根据边界条件以及上述的传输矩阵方程，计算出振动子各段的尺寸。用有限元分析软件对振动子的各段进行模态分析及优化，优化后的28 kHz超声振动子实物图如图2所示。

图2 28 kHz超声振动子实物图Fig.2 Physical map of 28 kHz ultrasonic vibrator

3 实验

3.1 实验平台

在超声破碎实验中，利用坐标支架来固定超声振动子，通过电机与丝杠可以实现超声振动子的垂直与水平方向的移动。利用超声电源和PC机调节超声破碎时的电功率和频率。图3为搭建好的超声破碎实验平台。

图3 超声破碎系统实验平台Fig.3 Experimental platform of ultrasonic crushing system

实验仪器主要包括WG-1000W型超声电源、PC机、超声振动子(谐振频率分别为20 kHz、25 kHz、28 kHz)、PV80A阻抗分析仪、坐标轴移动平台、BMC500系列生物显微镜、FA2004型电子天平、TD5A型离心机、烧杯(规格500 mL、杯身直径90 mm)。

实验材料与试剂主要有干燥的刚毛藻颗粒与扁藻颗粒、正己烷试剂、无水乙醚/石油醚(1:2)混合溶剂、氯仿试剂、蒸馏水。

3.2 实验方法

利用超声破碎实验平台，研究超声振动的频率、电功率、超声处理时间以及振动子工具头浸入溶液的深度等工艺参数对微藻细胞破碎率的影响。采用阻抗分析仪分别测量振子在空气负载和水负载下的导纳圆直径，根据电声效率计算公式(16)计算，得到28 kHz超声振动子的电声效率为73.4%。

其中，Dw为水负载时导纳圆的直径，Da为空气负载时导纳圆的直径，G0为水负载时谐振频率下的电导[20]。

为了评价细胞破碎率，用胶头滴管、量筒量取1 mL处理前的微藻溶液，通过高倍电子显微镜与血球计数板统计微藻溶液中微藻细胞的个数。再按照实验方法用滴管吸取超声破碎后的溶液，在显微镜下观察统计未被破碎的细胞个数。为提高实验的准确度，多次统计求取平均值，计算出细胞的破碎率，计算公式为

式(17)中，ψ表示细胞破碎率，Ni表示超声处理前计算细胞数目，Nj表示超声处理后计算细胞数目的平均值，在本实验中n=5，表示统计次数为5。

3.2.1 处理时间与超声电功率对细胞破碎率的影响

设置4个实验组，超声电功率分别设置为75 W、150 W、225 W、300 W。用电子天平称取25 g刚毛藻放入烧杯中，加入160 mL蒸馏水，微藻溶液的总深度为55 mm，工具头浸入溶液的深度是25 mm，采用纵振频率为28 kHz的振动子进行破碎实验，每隔5 min采集一次数据。

3.2.2 振动子频率对细胞破碎率的影响

设置3个实验组，纵振频率分别为20 kHz、25 kHz、28 kHz的超声振动子，用电子天平称取25 g刚毛藻放入烧杯中，加入160 mL蒸馏水，微藻溶液的总深度为55 mm，振动子浸入烧杯的深度为30 mm，超声电功率设置为225 W，每隔10 min采集一次数据。

3.2.3 工具头浸入溶液的深度对细胞破碎率的影响

设置8个实验组，利用PC机控制坐标平台的z轴上下移动从而改变工具头浸入溶液深度，浸入深度值分别为5 mm、10 mm、15 mm、20 mm、25 mm、30 mm、35 mm、40 mm。用电子天平称取25 g刚毛藻放入烧杯中，加入160 mL蒸馏水，超声振动子的工作频率为28 kHz，超声电功率设置为225 W，微藻溶液的总体深度是55 mm，每个浸入深度值超声处理时间为10 min，每隔5 min采集一次数据。

3.2.4 不同试剂萃取油脂效果的比较

用电子天平称取25 g刚毛藻加入160 mL的蒸馏水，采取前述获得的超声振动工艺参数进行细胞破碎处理。破碎结束后用吸管取出3份样品，每份样品15 mL，放入离心管中。在样品1中加入15 mL的甲醇和15 mL三氯甲烷，在样品2中加入30 mL无水乙醚/石油醚(1:2)的混合溶剂，在样品3中加入30 mL的正己烷。提取期间至少摇4次，提取时间为1 h，充分静置。用离心机以4500 r/min的转速离心样品溶液5 min，用注射器取出样品1下层溶液，样品2、样品3的上层溶液。对3份样品重复上述步骤，使油脂充分得到提取。合并取出的溶液，将溶液放入带盖试管中进行水浴加热，得到粗油脂。

3.2.5 两种常见微藻的油脂含量测定

刚毛藻和扁藻是两种常见的微藻，在高倍显微镜下面这两种微藻的细胞形状如图4所示。

图4 微藻细胞Fig.4 Microalgae cells

各取10 g刚毛藻与扁藻，加入160 mL的蒸馏水，在纵振频率25 kHz、电功率225 W条件下，超声破碎处理25 min。用吸管各吸取16 mL微藻破碎溶液，加入16 mL甲醇混合均匀，再加入16 mL三氯甲烷混匀，进行萃取，其间至少摇匀4次，萃取时间为1 h。离心5 min，用注射器取出下层液体，再在上层液体中加入16 mL三氯甲烷混匀进行萃取1 h，离心5 min，用注射器取出下层溶液，重复上述步骤，使充分提取。合并下层液体，置于称量皿中，通风厨过滤去除三氯甲烷，放置24 h。

4 结果与讨论

4.1 处理时间与超声电功率对细胞破碎率的影响

超声电功率分别设置为75 W、150 W、225 W、300 W的实验组的实验数据如表1所示。为了更直观地观察到超声电功率与超声处理时间对刚毛藻破碎率的影响，绘制折线图，如图5所示。

表1 不同超声电功率实验数据Table 1 Experimental data of different ultrasonic electrical power

根据表1和图5可以观察到，超声电功率为75 W的实验组在前20 min时间内，细胞破碎效果不明显，破碎率不足40%，相同的条件下，超声电功率分别为150 W、225 W、300 W的实验组细胞破碎率超过80%。说明75 W的超声电功率过低，超声振动子在提取溶液中所产生的超声波强度低，声空化效应微弱，所产生的空化泡数量少，空化泡破裂所产生的冲击波与剪切力，不能快速对刚毛藻细胞壁造成损伤。超声电功率分别为150 W、225 W、300 W的实验组在超声处理25 min时间内，随着处理时间增加，刚毛藻细胞破碎率增长迅速，均达到90%，但增加的趋势到25 min以后比较平缓，实验组之间差距不明显。原因是超声波强度增加到一定值，空化趋于饱和。通过生物显微镜观察到超声功率设置为225 W的实验组在处理时间分别为0 min、6 min、12 min、18 min时刚毛藻细胞的形状如图6所示。可以观察到在未对细胞进行处理时，刚毛藻细胞排列整齐，细胞壁厚实，细胞内容物清晰可见。随着处理时间的增加，刚毛藻细胞排列混乱，细胞内容物逐渐减少，完整的刚毛藻细胞越来越少。考虑到超声振动子的功耗因素，较为合理的超声电功率为225 W，处理时间为25 min。

图5 细胞破碎率与超声电功率、时间的关系Fig.5 Relationship between cell disruption rate and ultrasonic electrical power and time

图6 不同处理时间的细胞形状Fig.6 Cell shape at different treatment times

4.2 振动子频率对细胞破碎率的影响

超声频率分别为20 kHz、25 kHz、28 kHz的实验组的实验数据如表2所示。为了更为清晰直观地观察到超声频率与刚毛藻破碎率的关系，绘制折线图，如图7所示。

表2 不同超声频率实验数据Table 2 Experimental data of different ultrasonic frequencies

由图7可以观察到，在相同的条件下，刚毛藻细胞破碎率随着超声振动子的纵振频率的增大而增大，纵振频率为20 kHz时，细胞破碎效率较低。说明超声频率越高，所产生的声辐射力越大，引起的振动速度越大，对细胞壁的破坏更加剧烈。频率增大到一定值时，破碎率随着纵振频率的增加而增加得比较缓慢。从实验结果来看，在相同实验条件下，28 kHz与25 kHz时的细胞破碎率相差不大，并且随着超声频率的提高，产生空化效应的阈值也就越高，产生空化效应所需电功率就越大。根据超声辅助提取微藻油脂理论分析，相比于高频振动产生的声冲流以及声辐射作用，更希望获得更好的声空化效应。因此，纵振频率选为25 kHz较为合适。

图7 细胞破碎率与超声频率的关系Fig.7 Relationship between cell breakage rate and ultrasonic frequency

4.3 工具头浸入溶液的深度对细胞破碎率的影响

工具头浸入溶液中不同深度与刚毛藻细胞破碎率的实验结果如表3所示，为了更为清晰直观地观察到浸入深度与刚毛藻破碎率的关系，绘制折线图，如图8所示。

图8 细胞破碎率与浸入深度的关系Fig.8 Relationship between cell breakage rate and immersion depth

表3 不同深度下的实验数据Table 3 Experimental data at different d ep ths

由图8可以观察到，在超声振动时间相同的情况下，刚毛藻细胞破碎率随着浸入深度的增加呈现先增加后减小的趋势，在工具头浸入刚毛藻溶液总深度的二分之一左右时，细胞破碎率达到最大。原因是工具头浸入溶液总深度的二分之一时，声压分布较为均匀；而工具头浸入微藻溶液较深时，底部的压强太大，超声波产生的能量损耗比较大，对刚毛藻细胞壁的破坏作用遭到削弱。因此，超声振动子的工具头浸入溶液的最佳深度应为二分之一总深度。

4.4 不同试剂萃取油脂效果的比较

3份样品在添加萃取剂并充分融合静置后如图9所示。样品1为氯仿试剂萃取效果，样品2为无水乙醚/石油醚(1:2)的混合溶剂萃取效果，样品3为正己烷试剂萃取效果。通过离心机以4500 r/min的转速离心，并水浴加热去除溶剂后，得到的粗油脂如图10所示。

图9 样品溶液Fig.9 Sample solution

图10 提取的油脂样品Fig.10 Extracted oil sample

根据图9与图10可以观察到，正己烷试剂萃取静置分层不明显，从提取到的粗油脂样品量来分析，氯仿的萃取效果最好，无水乙醇-石油醚次之，正己烷的萃取效果最差。因此，选择氯仿试剂作为提取微藻油脂的试剂。

4.5 两种常见微藻的油脂含量测定

获得的刚毛藻以及扁藻的油脂如图11所示，图11(a)是从扁藻中提取的油脂，质量为0.0674 g，其提取率为6.74%，图11(b)是从刚毛藻中提取的油脂，质量为0.0815 g，其提取率为8.15%。可以得出刚毛藻的油脂含量要比扁藻的油脂含量高。

图11 粗油脂Fig.11 Crude oil

5 结论

本文阐述了超声辅助提取微藻油脂的机理，从超声振动处理时间、超声频率、超声电功率以及超声振动子的工具头浸入溶液深度等因素分析了超声波对微藻细胞破碎率的影响，获得了超声辅助提取微藻油脂的最佳工艺参数。实验结果表明：对于所研究的微藻溶液，超声振动最佳工艺参数为纵振频率25 kHz、电功率225 W、浸入溶液总深度的二分之一、超声振动处理25 min。在对破碎后的微藻溶液的萃取方法中，氯仿的萃取效果最好。对于常见的刚毛藻和扁藻，采用本文的超声辅助提取方法进行油脂提取，刚毛藻的油脂提取率更高。超声波在微藻油脂提取过程中具有显著的优点，如细胞破碎效率高、加工时间短、能耗低等。合理地利用超声辅助油脂提取的最佳工艺参数对于利用微藻进行产业化制备生物柴油以及相关高效能源转化装备的设计具有指导意义。