高通量测序技术对不同采奶环节细菌多样性的研究

闫艳华，曹慧慧，董李学，庞学良，谷守国，张丽芳，王岩，郑百芹,3

（1.唐山市食品药品综合检验检测中心，河北唐山063000；2.河北省农产品质量安全检测技术创新中心，河北 唐山063000；3.唐山市功能性农产品产业技术研究院，河北唐山063000）

0 引 言

生鲜乳（Raw Milk）是未经杀菌、均质等工艺处理的原奶的俗称，是各大养殖场送往乳企前奶农直接从牛体中获得的原奶[1-2]。天然优质的原奶产自健康动物的乳房，整个生产过程必须规范操作，为了加强乳品质量安全监督管理，我国颁布了《乳品质量安全监督管理条例》和相关法规标准等，不合格的原奶是不允许进入生产环节的[3-4]。生鲜乳处于乳制品供应链的最上游，是目前限制我国乳业持续健康发展的主要因素，为了保障生鲜乳的质量安全，必须规范各挤奶环节并保证采奶器具的清洁。影响原奶质量的微生物中数量最大的为细菌，因此研究奶牛养殖场中各采奶环节中细菌的多样性与差异性对监测原奶质量、提高奶制品品质及提高奶农收益都具有重大意义。

1 实 验

1.1 养殖场不同采样点概况

实验牧场选取河北唐山地区规模较大的荷斯坦奶牛养殖场，选取3个对储奶罐中生鲜乳质量有直接影响的关键性采奶环节进行取样，并以储奶罐中的生鲜乳作为阳性对照。4个不同取样点的具体编号分别为：C1（牛乳头消毒前C1.1-C1.6）、C2（牛乳头消毒后C2.1-C2.6）、E（采奶罩杯E1-E6）及M 1（储奶罐奶M 1.1-M 1.6）。

1.2 样品采集

选取河北唐山地区规模化奶牛养殖场，在奶牛养殖场的挤奶厅对采奶环节中的不同取样点分别进行采样，牛乳头消毒前、牛乳头消毒后采样：分别随机选取6头健康牛体并确保候选牛体乳房健康未见乳房炎，用无菌棉拭子对其乳头周围1 cm2的面积进行3次涂抹后迅速置于10 mL无菌生理盐水中；采奶罩杯的采样：挤奶厅随机选取6个采奶罩杯用无菌棉拭子擦拭其内表面后置于10 mL无菌生理盐水中送测序；储奶罐奶采样：储奶罐中的奶经过搅拌混匀后用液态乳铲斗从表面、中部、底部三点采样，每个点采集1 L，3个点采集到的3 L样品充分混合均匀后，取15 mL分别分装至6个样品采集管中送测序；所有样品采集后，立刻置于液氮中保存。

1.3 细菌DNA提取和PCR扩增

按照细菌DNA抽提试剂盒（E.Z.N.A.Stool DNA Kit，Omega）说明书进行各样点细菌总DNA抽提，以各样点的DNA作为PCR模板，扩增16S rRNA基因的V3-V4区。PCR反应的正反向引物分别为341F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806 R：3'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5'扩增后对PCR扩增产物进行纯化后通过HiSeq2500平台进行测序。

1.4 数据分析与过滤

委托华大基因通过HiSeq平台进行测序，下机数据过滤采取按窗口去低质量的方法：设置25 bp的窗口，如果窗口平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基；截短后的read长度低于原始read长度75%的，去掉整条序列。去除接头污染的reads（默认adapter序列有15 bp的overlap，设置为15 bp，允许错配数为3），去除含N的reads，并去除低复杂度的reads（默认reads中连续碱基长度≥10的为低复杂度reads），根据barcode和引物区分样本，barcode序列与测序reads比对允许的错配个数为0 bp。序列拼接使用软件FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列，得到高变区的Tags。拼接条件如下：①最小匹配长度15 bp；②重叠区域允许错配率为0.1[5-7]。

1.5 OTUs与多样性分析

利用UPARSE在97%相似度下进行聚类，得到OTU的代表序列，然后利用UCHIME（v4.2.40）将PCR扩增产生的嵌合体从OTU代表序列中去除，再使用usearch_global方法将所有Tags比对回OTU代表序列，得到每个样品的OTU的丰度统计表。通过软件USEARCH对拼接好的序列在97%相似度下进行聚类，得到OTU代表序列，采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行物种分类分析。利用OTUs进行微生物多样性分析[8-10]。

1.6 群落结构组成分析

为了得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析，并在界门纲目科属种水平统计各样本的群落组成。根据每个OTU中序列的条数得到OTU分布表，对物种进行丰度和热图进行分析[8,11-15]。

2 结果与分析

2.1 序列的拼接与组装

测序数据统计如表1，结果显示通过对挤奶前3个不同取样点及储奶罐中奶的细菌基因组测序，4个样品总计测得原始序列条数为1 152 394条，共产生9 029个OTU。其中E样品中的OTU最多，达到了2 497个OTU，M 1样品中的OTU最少，仅为2 047个OTU。OTU对应的是物种分类信息，每个OTU对应于一个不同细菌（微生物）种，通过OTU分析可以知道样品中微生物多样性和不同微生物的丰度。本研究中挤奶环节的4个不同取样点中OTU含量最多的为E即采奶罩杯，说明采奶罩杯中的细菌丰度最高，细菌物种数最多；储奶罐奶中OTU数目最少，推测可能由于生奶经过低温管道流入储奶罐的过程中部分细菌受低温影响无法存活；采奶罩杯是奶牛养殖场采奶环节中的主要设备，可直接接触牛乳头和生奶，采奶罩杯中的细菌总数和类型可直接影响生奶的质量和牛体的健康，这一研究结果提示我们保持采奶设备的清洁是严格把控原奶质量关的必要条件；进一步分析发现，牛乳头消毒前C1样品中OTU数目为2 267个，而牛乳头消毒后C2样品中的OTU数目为2 218，这一结果显示，荷斯坦奶牛挤奶前的乳头药浴至关重要，奶牛榨乳前乳头的清洁度对生奶质量的影响也同样不可忽视。

表1 样品间测序数据统计

不同取样点细菌群落OTU韦恩图如图1所示，4个样本中共同含有的OTU为1377个，其中C1独有145个OUT，C2独有126个OTU，E独有268个OUT，M 1独有259个OTU，分别占总各自OUT总数的6.39%，5.68%，10.7%，和12.7%。以上结果表明挤奶环节不同取样点的细菌组成存在一定差异，但挤奶环节4个取样点中的细菌物种大部分是一致的，说明这些细菌物种是同一环境中的优势菌种，是影响生鲜乳质量的关键微生物。另外，结果还显示挤奶环节的4个不同取样点中E取样点（采奶罩杯）中独有微生物种类最多，是影响生鲜乳质量的关键环节。

2.2 各样点细菌群落alpha多样性分析

以多样性指数Sobs（observed species：表征实际观测到的物种数目）做稀释曲线图，结果如图2所示，结果如图2所示，4个取样点24个样本的稀释曲线基本趋于平缓状态，说明所得序列基本可反映真实不同取样点的细菌群落结构，再增大数据量对OTU的发现也没有影响，样本的OTU覆盖度已基本饱和，说明测序数据量合理，更大的测序量不会引起物种多样性的显著增长，基于现有数据量的分析结果准确可靠。

图1 不同取样点细菌群落OTUs的维恩分析

图2 不同取样点细菌群落测序的稀释曲线

Alpha多样性指数分析是指对单个样品中物种多样性的分析，可以反映微生物群落中物种数量，通过一系列指数分析来估计微生物的物种丰富度(Chao1、Ace指数)和 多样性(Shannon、Simpson指数)，而Coverage指数代表覆盖度。Shannon、Simpson指数越大，则表示该样品中的物种越丰富，反之则物种多样性越低。各样品中的Alpha多样性指标如表2所示，由表2综合分析可知，不同样本的Alpha多样性指数如表2所示，不同取样点细菌类群Alpha多样性统计中的Chao指数、Ace指数差异显著（p＜0.05），各取样点的Chao指数在1018.7～1510.2；Shannon指数在4.827～5.779；Simpson指数在0.008～0.041；储奶罐奶M 1中的Shannon指数在4个取样点中最高，而Simpson指数明显低于其它3个取样点，这一结果说明储奶罐奶的细菌群落结构均匀度最好；牛乳头消毒前C1的Chao指数在4个取样点中最高，说明牛乳头消毒前的细菌菌群多样性高于其他组；综合分析发现采奶罩杯E中的Shannon指数与Chao指数都较高，说明采奶罩杯的细菌群落具有较高多样性。

2.3 挤奶环节各样点细菌群落结构组成分析

基于OTU的物种分类分析，在相似性为97%水平上，4个取样点的24个样本中的细菌种类共注释到33个门，76个纲，122个目，214个科，420个属和202个种。由图3可见，在门分类水平上，挤奶环节的4个取样点的优势菌门有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria），放线菌门（Actinobacteria）、螺旋菌门（Spirochaetae）、软壁菌门（Tenericutes）和梭杆菌门（Fusobacteria）。其中，各样点细菌相对丰度最高的菌门为厚壁菌门（Firmicutes），分别是C1占31.5%，C2占44.8%，E占44.7%，M 1占41.1%，其次为拟杆菌门（Bacteroidetes），在挤奶环节的各样点所占含量分别为C1 28.7%，C2 24.3%，E 21.3%，M 1 29.5%；再次为变形菌门（Proteobacteria）其在挤奶环节各样点的含量分别为C1 21.2%，C2 15.9%，E 17.4%，M 1占15.5%；另外，储奶罐奶（M 1）样本中螺旋菌门（Spirochaetae）占比为1.75%、软壁菌门（Tenericutes）的含量为2.45%，均高于其他3个取样点。

图3 样本中细菌在门分类水平的比较

表2 样品间Alpha多样性统计

进一步分析发现（图4），24个样本在属水平上已注释到的物种丰度Top18菌属，分别是不动杆菌属（Acinetobacter）、弓形杆菌属（Arcobacter）、节细菌属（Arthrobacter）、丁 酸 弧 菌 属（Butyrivibrio）、金 黄 杆 菌 属（Chryseobacterium）、粪球菌属（Coprococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、水栖菌属（Enhydrobacter）、黄氏诺尔氏菌（Knoellia）、考克氏菌属（Kocuria）、球菌属（Macrococcus）、颤螺旋菌属（Oscillospira）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、反刍杆菌属（Ruminobacter）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、密螺旋体属（Treponema）。各样点含量最多的优势菌属为不动杆菌属（Acinetobacter），分 别 是C1占13.52%，C2占6.23%，E占5.84%，M 1占5.03%，其在4个样点中的平均含量为7.67%；其次是节细菌属（Arthrobacter），分别在C1中占细菌总数的7.71%，C2中占细菌总数的4.00%，在取样点E中占细菌总数的3.66%，M 1中占0.86%，其在4个样点中的平均含量为4.06%；在细菌属分类水平上，相对含量第三的是鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium），分别是C1占2.76%，C2占1.02%，E占0.50%，M 1占0.17%，其在4个样点中的平均含量为1.11%；挤奶环节4个不同取样点，细菌菌群在属水平分类上存在菌群丰度差异性：不动杆菌属、节细菌属、鞘氨醇杆菌属和巨型球菌属这四类优势菌属在挤奶环节的牛乳头消毒前（C1）的含量均高于其他3个取样点；进一步分析发现采奶罩杯（E）中金黄杆菌属（Chryseobacterium）含量为2.71%，棒状杆菌属（Corynebacterium）含量为2.36%，Chryseobacterium和Corynebacterium在奶牛养殖场采奶全链条各取样点的采奶罩杯E中的含量均高于其他3个取样点；牛乳头消毒后（C2）中水栖菌属（Enhydrobacter）含量为2.45%，嗜冷杆菌属（Psychrobacter）含量为1.72%，Enhydrobacter与Psychrobacter在牛乳头消毒后C2中的含量均高于其他3个取样点；而普氏菌属（Prevotella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、密螺旋体属（Treponema）在储奶罐奶（M 1）中的含量分别为1.85%、1.92%、1.68%，均高于其他3个取样点。

图4 属分类水平不同取样点细菌群落的多样性

2.4 不同取样点细菌群落结构多样性分析

从属水平各取样点细菌群落Top18菌属做热图（图5），热图中共显示挤奶不同环节与储奶罐奶中18个细菌菌属，分别是不动杆菌属（Acinetobacter）、弓形杆菌属（Arcobacter）、节细菌属（Arthrobacter）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、粪球菌属（Coprococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、水栖菌属（Enhydrobacter）、黄氏诺尔氏菌（Knoellia）、考克氏菌属（Kocuria）、球菌属（Macrococcus）、颤螺旋菌属（Oscillospira）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、反刍杆菌属（Ruminobacter）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、密螺旋体属（Treponema）。从图中可以看出，挤奶环节的4个取样点属水平存在差异性，牛乳头消毒前（C1）细菌群落丰富度最高，牛乳头消毒后（C2）与采奶罩杯（E）中的细菌相对丰度基本持平，储奶罐奶（M 1）细菌相对丰度最低，推测与挤奶前的消毒及采奶设备的消毒有必然联系。牛奶中的微生物主要来自奶牛体内以及挤奶、贮运、运输等过程中的污染，生牛乳中的微生物中细菌的数量最多，奶牛发生乳房炎时牛奶中会出现大量的金黄色葡萄球菌、链球菌及化脓杆菌等致病菌，乳头消毒过程可以避免乳头上的致病菌进入到原奶中，采奶罩杯可以直接接触牛乳头，采奶罩杯的清洁度也可以直接影响原奶的品质[12-14，16-18]。本研究中注释到的优势菌门有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria），放线菌门（Actinobacteria）等；优势菌属有不动杆菌属（Acinetobacter）、弓形杆菌属（Arcobacter）、节细菌（Arthrobacter）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）等，这一研究结果与前人研究结果部分一致[19-22]；优势菌属中有一些是致病菌如不动杆菌属和球菌属，不动杆菌属是人类的条件致病菌，当机体抵抗力降低时容易引起机体感染，球菌属特别是金黄色葡萄球菌是泌乳牛乳腺炎的主要致病菌且易受环境影响，研究表明：乳头、牛舍、挤奶设备等都是金黄色葡萄求均可能的污染源[23-25]。Oliveria等研究发现泌乳牛乳头挤奶前的清洗程度直接影响生鲜乳中金黄色葡萄球菌的含量[26-27]；采奶罩杯中的细菌含量可以直接影响储奶罐中生鲜乳的质量，因此采奶罩杯的消毒与灭菌环节对生鲜乳的质量控制同样十分关键。防治生鲜乳微生物污染的最好方法是控制或去除每种有害微生物的来源，但由于奶牛养殖场特别的生产方式，达到标准非常困难[3,28-29]。因此，及时、准确进行微生物趋势分析以达到预警效果，以及建立安全生产规程，是防患于未然的高效手段。

图5 属分类水平不同取样点细菌丰度热图

3 结 论

本研究结果表明，奶牛养殖场挤奶环节中优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，优势菌属有不动杆菌属、弓形杆菌属、节细菌属、丁酸弧菌属等，采奶环节不同取样点的细菌种群结构多样性与丰富度差异较大，梭菌属（Clostridium），丁酸弧菌属（Butyrivibrio），和水栖菌属（Enhydrobacter），在乳头消毒前（C1）与乳头消毒后（C2）相对含量差异极为显著（P＜0.05），说明挤奶前的乳头消毒环节至关重要，alpha-多样性分析发现采奶罩杯E中的Shannon指数与Chao指数都较高，说明采奶罩杯的细菌群落具有较高多样性；因此采奶罩杯的消毒与灭菌环节对生鲜乳的质量控制同样十分关键。