高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中维生素B1含量的两种前处理方法比较

李猛，陈美君

（黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨150028）

0 引 言

维生素B1是一种重要的水溶性维生素，对维持机体的正常代谢和功能起着重要作用，而我们人体自身无法合成，必须从食物中获得，在婴幼儿配方奶粉中是必须添加的营养强化剂之一，因此准确测定婴幼儿配方奶粉中维生素B1的含量十分重要[1-6]。目前文献报道中测定婴幼儿配方奶粉中维生素B1的方法主要有高效液相色谱法[7-9]、高效液相色谱法串联质谱法[10-12]等。其中液相色谱串联质谱法具有前处理简单，不需要衍生化，灵敏度高等特点，但仪器设备昂贵，对实验室条件和检验员等要求高，检验成本高等缺点。而高效液相色谱法具有仪器较为普及，检测成本低且检出限满足实验需求等优点，所以目前主要采用的方法为高效液相色谱法。其中国家标准GB5413.11-2010婴幼儿食品和乳品中维生素B1的测定和最新食品标准食品中维生素B1的测定GB5009.84-2016第一法，均采用高效液相色谱法[13-14]。

本文通过分析维生素B1测定的反应原理，认为衍生剂的配置和添加量是整体实验中的一个关键操作点，所以在原有的标准和文献的基础上，优化了衍生剂条件，并对样品经过高温高压酸水解法和直接调p H法两种不同前处理方法进行了比较分析。

1 实 验

1.1 材料与试剂

维生素B1标准品（Dr.Ehrenstorfer）；盐酸硫胺素，纯度≥99%；甲醇，色谱纯；浓盐酸、乙酸钠、氢氧化钠、冰乙酸、正丁醇、铁氰化钾均为分析纯；木瓜蛋白酶，酶活力≥800 U/mg；淀粉酶，酶活力≥3700 U/g。

1 mol/L盐酸溶液：移去85 mL浓盐酸加水稀释至1 000 mL，摇匀。

0.1 mol/L盐酸溶液：移去8.5 mL浓盐酸加水稀释至1 000 mL，摇匀。

0.01 mol/L盐酸溶液：量取0.1 mol/L盐酸溶液50 mL，用水稀释并定容至500 mL，摇匀。

0.05 mol/L乙酸钠溶液：称取6.80 g乙酸钠，加900 mL水溶解，用冰乙酸调p H为4.0～5.0之间，加水定容至1 000 mL。经0.45μm微孔滤膜过滤后使用。

2.0 mol/L乙酸钠溶液：称取27.2 g乙酸钠，用水溶解并定容至100 mL，摇匀。

100 g/L氢氧化钠溶液：称取25 g氢氧化钠，用水溶解并定容至250 mL。

混合酶溶液：称取1.76 g木瓜蛋白酶、1.27 g淀粉酶，加水定容至50 mL，涡旋，使呈混悬状液体，临用前配置。

20 g/L铁氰化钾溶液：称取2 g铁氰化钾，用水溶解并定容至100 mL，摇匀，临用前配制。

碱性铁氰化钾溶液（衍生剂A）：将5 mL铁氰化钾溶液与200 mL氢氧化钠溶液混合摇匀，临用前配制。

碱性铁氰化钾溶液（衍生剂B）：将10 mL铁氰化钾溶液与200 mL氢氧化钠溶液混合摇匀，临用前配制。

碱性铁氰化钾溶液（衍生剂C）：将15 mL铁氰化钾溶液与200 mL氢氧化钠溶液混合摇匀，临用前配制。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪，配Waters 2475荧光检测器；高速离心机，Eppendorf centrifuge 5430R；pH计，Sartorius；手提式高压灭菌锅，上海博讯；漩涡震荡器，Vortex mixer xw-80A。

1.3 色谱条件

色 谱 柱，Phenomenex C18 150×4.6mm；柱温30℃；流动相：0.05 mol/L乙酸钠溶液-甲醇（65+35）；进样量10μL；运行时间5 min；检测波长：激发波长375 nm，发射波长435 nm。

1.4 标准储备溶液的配置

准确称取盐酸硫胺素标准品13.1 mg，相当于11.659 mg硫胺素，用0.01 mol/L盐酸溶液溶解并定容至10 mL，摇匀，置于0～4℃冰箱中，保存期为3个月，浓度为1.1659 mg/mL。

2 样品测定方法

2.1 样品前处理的两种方法

2.1.1样品前处理方法一

称取3～5 g样品于100 mL锥形瓶中（带有软质塞子），加60 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，充分摇匀，塞上软质塞子，高压灭菌锅中121℃保持30 min。水解后冷却至室温，摇匀后用2.0 mol/L乙酸钠溶液调p H至4.0左右，加入2.0 mL混合酶溶液，摇匀后置于37℃培养箱中过夜，将酶解液全部转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀过滤，取上清液备用。

2.1.2样品前处理方法二

称取3～5 g样品于100 mL锥形瓶中，加50 mL热蒸馏水（50～60℃）溶解，用1.0 mol/L盐酸调pH至1.7左右后，再用100 g/L氢氧化钠溶液调p H至4.5左右，摇匀后将样液全部转移至100 m L容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀过滤，取上清液备用。

2.2 试液衍生化

准确取上清液1 mL于10 mL指型瓶中，加入1 mL衍生剂A，涡旋衍生10 s，准确加入3.0 mL正丁醇，涡旋萃取1 min，4 500 r/min离心10 min，离心后取上层正丁醇相经0.45μm有机微孔滤膜过滤，取滤液于进样瓶中供分析用。若维生素B1浓度超出线性范围的最高浓度值，应取上清液稀释适宜倍数后，重新衍生进样。

2.3 标准曲线的绘制

另取1.0 mL标准系列工作液，与试液同步进行衍生化，以维生素B1标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

3 结果与讨论

3.1 维生素B1反应原理

维生素B1是由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基结合而成[15]，其的结构式如图1所示，维生素B1的噻唑环在碱性介质中可开环，再与嘧啶环上的氨基环合，经铁氰化钾氧化剂氧化成具有荧光的硫色素，硫色素溶于正丁醇中成蓝色荧光[16-17]。反应如图2所示。硫色素反应为维生素B1的专属反应，在一定条件下形成的硫色素与维生素B1浓度成正比。

图1 维生素B1结构式

图2 维生素B1测定的反应原理

3.2 衍生剂的确定

根据维生素B1的测定原理，认为在测定维生素B1含量时，衍生剂中的氢氧化钠提供了碱性介质，使噻唑环开环，再与嘧啶环上的氨基环合后经氧化剂铁氰化钾氧化生成硫色素，该反应是维生素B1的专属反应，因此氢氧化钠与铁氰化钾的浓度直接影响最终的定量结果，所以认为衍生剂的配置和添加量是一个关键操作点，本实验尝试配置不同浓度铁氰化钾溶液观察其对定量的影响，再通过添加不同体积的衍生剂考察氢氧化钠添加量对测定结果的影响，如表1所示，使用两种前处理方法，测定同一样品，观察维生素B1含量的变化，确定最佳的铁氰化钾浓度和衍生剂的添加量，比较结果如图3所示。发现使用衍生剂A时，添加1 000μL对样液进行衍生，测定结果最高，衍生反应相对更完全。

表1 不同浓度铁氰化钾与衍生剂添加量

图3 维生素B1含量与衍生剂的关系

3.3 高温高压酸水解对维生素B 1测定的影响

方法一中，样品需要经过121℃高温，酸水解30 min，通过试剂空白加标的方法，考察维生素B1在不受样品基质影响时，在121℃高温高压下酸水解30 min对其稳定性的影响。取标准储备液50μL于100 m L棕色容量瓶中，用水定容后摇匀待衍生，做6个平行样品；另取标准储备液50μL于100 mL锥形瓶中，加60 mL 0.1 mol/L盐酸溶液，充分摇匀，后与方法一中一致（2.1.1），做6个平行样品；所有样品与标准工作液同步衍生上机测定，结果如表2，由表可见，高温高压水解对维生素B1的稳定性没有显著性差异，认为其对维生素B1的定量分析没有显著影响。

表2 水解对维生素B1稳定性的影响

3.4 方法验证

3.4.1线性范围和检出限

准确吸取1 mL维生素B1标准储备液于10 mL容量瓶中，用水定容，摇匀配置成标准中间液，浓度为0.1166 mg/m L。再分别取维生素B1标准中间液25、50、100、150、200、250μL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，与试液同步衍生。结果见表3，维生素B1线性关系良好。以信噪比为3时的进样质量浓度为最低检出质量浓度，根据样品前处理最终计算得出方法的检出限为0.03 mg/100 g。

表3 峰面积、线性方程与相关系数

3.4.2两种样品前处理方法的回收率和精密度

选择2个婴幼儿配方乳粉作为基质，分别添加3个浓度的标准溶液，采用两种前处理方法处理后，标准工作液与试液同步衍生，对其回收率和精密度进行计算比较，结果见表4，样品前处理方法一回收率在75.3%～88.1%之间，相对标准偏差RSD在1.27%～4.49%之间。样品前处理方法二回收率在88.1%～97.3%之间，相对标准偏差RSD在1.08%～4.09%之间。比较发现样品前处理方法二的回收率和精密度均优于样品前处理方法一。

3.4.3两种样品前处理方法测定实际样品数据的对比

表4 两种样品前处理方法回收率和精密度（n=6）

表5 两种前处理方式数据对比

选取5种不同品牌的婴幼儿配方奶粉，样品分别用两种前处理方法进行处理，然后与标准工作液同步衍生，测定样品中维生素B1的含量，5个样品，连续测定3天，每次做2个平行样品，见表5。结果显示方法二的测定结果均高于方法一，且3天的重现性也要优于方法一，该结果与回收率结果相符。分析原因认为，方法一中需要进行高温高压酸解同时结合酶解，该处理使得样品中大量的蛋白质分解成肽或氨基酸等物质，这些物质可能会吸附游离态的维生素B1或与其再次反应结合，而雷涛[18]，王帅帅[19]指出，婴幼儿配方奶粉中水溶性维生素主要来源于人为添加的，呈游离态，而本身含有的虽多为结合态，但含量极低。从而导致维生素B1损失，无法与碱性铁氰化钾进一步衍生产生硫色素，最终导致回收率偏低，测定结果低。因此认为，在使用方法一作为前处理方法时，应同时做样品加标回收和质控样品，在最终结果计算时应结合考虑回收率和质控样品的值，确定是否需要折算回收率。

4 结 论

本实验优化了衍生剂的条件，即当取1 mL样液或标准工作液进行衍生时，加1 mL衍生剂A进行衍生，衍生效率最高。同时比较了两种方法的回收率和精密度，方法一的回收率在75.3%～88.1%之间，相对标准偏差为1.27%～4.49%。方法二的回收率在88.1%～97.3%，精密度在1.08%～4.09%之间，比较发现方法二在回收率和精密度上要优于方法一，两种方法均适用于婴幼儿配方乳粉中维生素B1的测定。

前处理方法一是基于现有国家标准方法，其优点在于适用范围广，可测定含淀粉类等幼儿配方食品，但是回收率低，因此认为在测定一批样品时应同时做质控样品和回收率，在计算结果时，应考虑是否折算回收率，避免结果偏低。

前处理方法二的优点是操作简单，重现性好，且回收率高，测定结果更接近于真实值，适用于大批样品的快速准确测定。其缺点为如果想测定含淀粉的样品，还需要进一步优化方法，添加淀粉酶酶解样品，以释放结合态的维生素B1。