细胞外信号调节激酶1/2在肾癌中的表达及临床意义

李峰，赵涛，邵继春

(核工业四一六医院泌尿外科，四川 成都 610051)

肾癌属于泌尿系统恶性肿瘤。据统计，全球范围内每年新增肾癌患者约27万例肾癌，死亡人数接近11.6万，目前发病率呈上升趋势，可能与生活环境、饮食习惯的改变及诊断技术的改进有关[1]。临床研究证实，肾癌患者对放疗、化疗不敏感，手术是治疗早期肾癌的首选方式[2]，但仍有很大一部分患者术后复发、预后较差。随着研究的不断深入，多种基因的异常表达已被证实参与恶性肿瘤的侵袭与转移。细胞外调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族成员，是通过上游MAPK 1/2磷酸化而激活的蛋白激酶/苏氨酸激酶，该信号通路是由各种细胞外刺激和细胞内信号传导启动的，并最终作用于多种生理和病理途径[3]。近期，Hoerner等[4]指出，磷酸化的ERK1/2(p- ERK1/2)的作为一种关键的癌症信号蛋白，与肾癌的发生及发展密切相关；Lee等[5]也证实ERK1/2在肾透明细胞癌中的表达水平与患者预后相关。本研究通过检测78例肾癌患者癌组织及癌旁组织中ERK1/2及p-ERK1/2的表达情况，结合患者临床资料分析其临床意义，探讨其在肾癌发生发展中的作用，为探寻肾癌致病分子机制及治疗方向积累数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年6月至2019年1月于核工业四一六医院行手术切除的78例肾癌患者为研究对象。入组标准：(1)符合《中国肾癌临床治疗指南：2015版》中肾癌诊断标准[6]经术后病理切片确认；(2)首次行手术切除治疗；(3)术前均未接受放疗、化疗；(4)临床资料完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者。78例肾癌患者中，男性50例，女性28例；年龄42～80岁，平均(61.35±18.28)岁；临床分期Ⅰ-Ⅱ 期患者46例，Ⅲ-Ⅳ 期患者32例；淋巴结转移患者20例，远处转移患者16例；病理Fuhrman 分级为G1者33例，G2+G3者45例。78例肾癌患者经门诊或电话随访12～60个月，随访截止日期为2020年1月31日。本研究经医院伦理委员会批准，患者自愿参加试验并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 小鼠抗人ERK1/2单克隆抗体、小鼠抗人p-ERK1/2单克隆抗体(货号：AM2189b)购自美国ABGENT公司，兔抗小鼠二抗(货号：PAB9358)购自上海群己生物科技有限公司，DAB 显色试剂盒(货号：AR1022)购自武汉博士德生物工程有限公司。ERK1/2及p-ERK1/2阳性对照为已知染色阳性的肾癌组织切片，以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗为阴性对照。

1.2.2 免疫组化法(三步法)测定ERK1/2及p-ERK1/2表达 将手术切除的肾癌及距离病灶超过3 cm的癌旁组织，采用10%的甲醛溶液固定，制成石蜡标本，将标本制备成厚度为4 μm的组织切片；采用二甲苯进行脱蜡，15 min×3 次；采用浓度为90%、85%、75%、70%的乙醇依次浸片，每次5 min；为避免内源性过氧化物酶造成影响，采用3%的H2O2/甲醇溶液浸泡10 min；采用0.125%的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)胰蛋白酶抗修复液进行30 min的修复；采用胎牛血清封闭30 min，加入一抗小鼠抗人ERK1/2/ p-ERK1/2单克隆抗体(1∶150)于4 ℃条件下孵育过夜；于次日加入标记生物素的二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)室温条件下孵育30 min，加入二氨基联苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)显色液，采用自来水充分冲洗后，采用苏木素染色、脱水、透明、中性树胶封固。

1.2.3 结果判定 采用双盲阅片法，由病理科医师于光镜下对阳性细胞的数量进行观察，ERK1/2及p-ERK1/2阳性表达均为细胞核或细胞质内出现黄色或棕黄色颗粒。随机选取10个高倍视野(×400)对阳性细胞进行计数，参照Beeskey分级方法，每个视野选取100个细胞，以阳性细胞数≥10% 为阳性，以无阳性细胞或阳性细胞数<10%为阴性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 肾癌组织与癌旁组织中ERK1/2及p-ERK1/2表达情况比较

肾癌组织中，ERK1/2及p-ERK1/2阳性表达率均高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 肾癌组织与癌旁组织中ERK1/2及p-ERK1/2表达情况比较[n(%)]

2.2 不同病理特征肾癌患者癌组织中ERK1/2及p-ERK1/2表达情况比较

不同性别、年龄、肿瘤直径患者癌组织ERK1/2及p-ERK1/2阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；临床分期为Ⅲ-Ⅳ 期、有淋巴结转移、远处转移、病理Fuhrman 分级为G2+G3者癌组织中ERK1/2及p-ERK1/2阳性表达率分别高于临床分期Ⅰ-Ⅱ 期、无淋巴结转移、远处转移、病理Fuhrman 分级为G1者，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同分期肾癌患者癌组织中ERK1/2及p-ERK1/2表达情况比较[n(%)]

2.3 癌组织中ERK1/2、p-ERK1/2表达情况与肾癌患者生存情况的相关分析

Kaplan-Meier生存分析结果显示，相较于ERK1/2、p-ERK1/2阴性表达者，肾癌组织中ERK1/2、p-ERK1/2阳性表达的患者生存情况较差(χ2=20.207，P<0.001；χ2=17.132，P<0.001)。见图2。

3 讨论

肾脏恶性肿瘤占恶性肿瘤的2%[7]，是世界上第13位最常见的恶性肿瘤，肾癌的发病率在发达国家较高，欧洲和北美的发病率普遍高于印度、非洲和中国[8]。肾癌的发生发展涉及多种因素，随着表观遗传学研究的不断深入， MAPK/ERK信号通路在一定程度上决定了细胞分裂、分化及凋亡，与恶性肿瘤的发生及发展密切相关，ERK1/2是该通路上较多的蛋白激酶，也是MAPK/ERK信号通路的主要调节因子，正常情况下，位于胞浆内的ERK1/2 处于静止状态，磷酸化后的ERK1/2被激活后成为p-ERK1/2，可快速转移至细胞核，对转录因子活性进行调节，最终改变细胞代谢与功能，参与形成恶性肿瘤细胞特定的恶性生物学过程[9-10]。本研究中，78例患者癌组织中ERK1/2及p-ERK1/2阳性表达率均高于癌旁组织(P<0.05)，提示其与肾癌的发生密切相关。刘玉等[11]发现ERK1/2在食管鳞癌石蜡标本癌组织中阳性表达率显著高于对应癌旁组织；Sinha等[12]发现人透明细胞肾细胞癌细胞内ERK1/2激活，两者均与本文研究结论基本一致。

通过进一步分析发现，临床分期为Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴结转移、远处转移、病理Fuhrman 分级为G2+G3者的癌组织中ERK1/2及p-ERK1/2阳性表达率更高。仝伟兵等[13]发现，p-ERK1/2阳性表达与患者临床分期、肿瘤分化程度以及淋巴结转移情况密切相关；王艳军等[14]表明，ERk1/2蛋白表达水平增加可能参与肝内胆管细胞癌进展；程杨等[15]证实ERK1/2激活后，宫颈癌细胞株SiHa细胞侵袭能力明显增强。本研究中Kaplan-Meier生存分析结果显示，肾癌组织中ERK1/2、p-ERK1/2阳性表达的患者生存情况较差。Zhao等[16]指出，p-ERK1/2的表达被抑制后，肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭活性随之受到抑制；Gao等[17]指出，p-ERK1/2高表达的肝癌患者的总生存期及无复发生存期均较差；Zhao等[18]发现，ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的阳性表达与非小细胞肺癌患者不良预后相关；Fan等[19]指出，在首次确诊的多发性骨髓瘤患者中，p-ERK1/2的高表达与总生存期及无复发生存期缩短显著相关；Lee等[5]发现p-ERK1/2的高表达与无进展生存期缩短相关，不良预后风险较高，以上均与本研究结论一致。但是，本研究样本量较少，研究结论仍需大样本多中心试验进行验证，ERK1/2能否作为肾癌的治疗靶点，仍需进一步分析。

综上所述，肾癌组织中存在ERK1/2及p-ERK1/2的高表达，且其表达水平与患者临床分期、淋巴结转移、远处转移、病理Fuhrman 分级及生存期相关。