丙泊酚介导细胞自噬及Nrf2信号通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

程少飞，陈娟，程晶晶

(邯郸市中心医院麻醉科，河北 邯郸 056008)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)指心肌组织缺血后再次获得血液灌注时伴随的心肌损伤，临床可表现为心律严重失常、心室功能降低、心肌梗死面积扩大[1]。随着我国老龄化加重，冠心病、急性心肌梗死等缺血性心脏病的发生率呈逐渐增长趋势。溶栓、经皮冠状动脉介入手术及冠状动脉旁路移植术治疗可以帮助缺血性心脏病患者恢复心肌血液供给，但同时也会引起MI/RI损伤[2]。MI/RI损伤严重程度与缺血时间、侧支循环情况以及再灌注条件存在密切关系，且常伴有心肌细胞凋亡和自噬过度。丙泊酚属于镇静药物，具有起效快、反应迅速和不良反应较少的特点，有良好的镇静、抗氧化功效，并且还能改善MI/RI损伤和脑缺血再灌注损伤[3-5]。细胞自噬属于机体自我代谢更替的防御过程，同时也参与多种疾病发生或进展。近年研究[6]表明，全身麻醉药物对心肌组织的保护作用可能与调节心肌细胞自噬有关。核转录因子E2相关因子2(nuclear transcription factor E2-related factor 2，Nrf2)信号通路在氧化应激调解中具有重要作用[7]，但有关丙泊酚与Nrf2信号通路关系的研究报道较少。本研究通过建立MI/RI损伤大鼠模型，旨在探讨丙泊酚对MI/RI损伤的保护作用是否与细胞自噬、Nrf2信号通路有关，以期能为临床缓解MI/RI损伤提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级雄性SD大鼠，体质量250～300 g[广州中医药大学，许可证号：SCXK(粤)2019-0047]，于SPF级饲养环境培育：温度20～25 ℃，湿度50%～55%，昼/夜时间均为12 h，全天自由饮水、进食，购回后适应性饲养1周。本实验均通过动物伦理委员会批准，遵守3R原则。

丙泊酚(2078-54-8，TargetMol)，CK-Mb试剂盒(QY-BM11392，上海乔羽生物科技有限公司)，Mb试剂盒(0-027530，上海江莱生物科技有限公司)，cTnI试剂盒(BS-E12272R1，广州徕智生物科技有限公司)，乳酸脱氢酶(Lactate dehydro-genase，LDH)活力检测试剂盒(XFE1020，上海信帆生物科技有限公司)，超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(K-F4377，上海科顺生物科技有限公司)，丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)试剂盒(QC11820-B，上海钦诚生物科技有限公司)，ECL试剂盒(WB2014，上海经科化学科技有限公司)，DMSO(D2652-100ML，Sigma)，LC3-II/LC3-I抗体(ABC929，广州东锐科技有限公司)，Beclin1、Nrf2抗体(ATA25356、ATA34138，武汉益普生物科技有限公司)，P62抗体(SPC-219D-A390-E，艾美捷科技有限公司)，HO-1抗体(bs-0827R-1，上海恒斐生物科技有限公司)，SD-001/SN-002 MinuteTM总蛋白提取试剂盒(SD-001/SN-002，英文特生物技术(北京)有限公司)。Avanti J-15R冷冻离心机(Beckman Coulter)，Primo Star iLED正置荧光显微镜(Carl Zeiss)，R407小动物呼吸机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，RM2255全自动轮盘式切片机(LEICA)，SuPerMax 3000AL多功能酶标仪(上海闪谱生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制备 60只SD大鼠禁食12 h后随机分为假手术组、模型组和丙泊酚组，每组各20只。模型组和丙泊酚组采用结扎左冠状动脉前降支方法制备大鼠MI/RI模型[8]，缺血心肌表现出发绀、膨出迹象，有两个以上ST段抬高，T波高耸、或者QRS波增高增宽与T融合，表明心肌缺血形成。结扎30 min后松开结扎线，心电图ST段恢复或与缺血前水平相似，表明大鼠缺血再灌注模型建立成功。剔除结扎前心电图异常或制模过程中死亡大鼠， 其余MI/RI模型制备大鼠均制模成功。见图1。

1.2.2 缺血再灌注 丙泊酚组心肌缺血前15 min给予静脉输注丙泊酚6 mg·kg-1·h-1至再灌注2 h，模型组及假手术组静脉输注生理盐水3 mL·kg-1·h-1，再灌注2 h。

1.2.3 指标检测 (1)心功能指标检测：再灌注2 h后，采用超声心动图检查各组大鼠左心室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS)、左心室壁厚度(LVWT)、心率(HR)、左室收缩压(LVSP)水平。(2)心功能损伤标志物检测：心功能心电图监测结束后，每组随机选取5只大鼠，取股动脉血5 mL，3 000 rpm离心15 min，取上清液储存于-80 ℃，采用ELISA法检测CK-Mb、Mb、cTnI水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。重复3次。(3)心肌组织HE染色：每组随机选取5只大鼠，取心脏组织固定于10%甲醛中性溶液，常规石蜡包埋、切片(5 μm)、脱蜡、水化、苏木精和伊红染色、脱水、透明、中性树胶封片后在高倍镜下观察大鼠心肌组织病理学变化。(4)心肌组织氧化应激因子检测：取0.4 g心肌组织，加入4 ℃ 1 mL 0.9% NaCl溶液研磨制成组织匀浆，2 000 rpm离心10 min，取上清液存储于-80 ℃，采用ELISA法检测LDH、SOD、MDA水平，操作严格参照试剂盒说明书进行。重复3次。(5)Western blot检测：提取心肌组织总蛋白、Bradford调整蛋白浓度至一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至PVDF膜，密封2 h，加入P62、Nrf2、HO-1、LC3-II/LC3-I、Beclin1、β-actin一抗(1∶500)，然后4 ℃孵育过夜， TBST漂洗40 min，加入经HRP标记过的二抗(1∶500)继续孵育1 h，参照ECL试剂盒说明书进行显影、定影，收集影像。重复3次。用UVPBio-Imaging Systems扫描蛋白质条带，并用Image J软件进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠心脏功能指标水平比较

与假手术组相比，模型组LVEF、FS、LVWT、HR、LVSP水平降低(P<0.05)；与模型组相比，丙泊酚组HR、LVSP、LVEF、FS、LVWT水平升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠心脏功能指标水平比较

2.2 各组大鼠CK-Mb、Mb、cTnI含量比较

与假手术组相比，模型组CK-Mb、Mb、cTnI水平升高(P<0.05)；与模型组相比，丙泊酚组CK-Mb、Mb、cTnI水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠CK-Mb、Mb、cTnI含量比较

2.3 各组大鼠心肌组织HE染色

假手术组大鼠的心肌组织细胞排列规则、均匀、紧密，且心肌纤维未见明显变性、坏死；模型组大鼠的心肌组织细胞呈散乱分布，丙泊酚组大鼠的心肌组织损伤情况较模型组明显改善。见图2。

2.4 各组大鼠心肌组织MDA、SOD、LDH含量比较

与假手术组相比，模型组SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平、LDH活性升高(P<0.05)；与模型组相比，丙泊酚组SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平、LDH活性降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织MDA、SOD、LDH含量比较

2.5 各组大鼠心肌组织自噬、Nrf2信号通路相关蛋白水平比较

与假手术组相比，模型组P62、Nrf2、HO-1蛋白水平降低(P<0.05)，LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白水平升高(P<0.05)；与模型组相比，丙泊酚组P62、Nrf2、HO-1蛋白水平升高(P<0.05)，LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白水平降低(P<0.05)。见图3。

3 讨论

介入治疗术法是快速恢复缺血性心脏血供的重要方式之一，我国采取经皮冠状动脉介入治疗已超过40万人[9]，该治疗方式虽然可以减低复缺血性心脏病患者死亡风险，但治疗时也伴有MI/RI损伤，严重时还可产生不可逆损伤[10]。本研究结果显示，MI/RI损伤大鼠的HR、LVSP、LVEF、FS及LVWT水平降低，血清CK-Mb、Mb、cTnI水平升高；心肌病理结果显示，心肌组织细胞呈散乱分布，而在MI/RI制备期间给予丙泊酚处理可以明显缓解上述MI/RI损伤情况。MI/RI损伤可使氧自由基增多、钙离子含量升高，线粒体能代谢出现障碍，增加心肌损伤的严重程度[11-12]。CK-Mb、Mb、cTnI是检测心肌损伤的标志物，肌钙蛋白是分布于心肌细胞内纤维上的一种调节蛋白，cTnI是肌钙蛋白的三大亚单位之一，大部分以结合形式分布于肌原纤维上，少量以游离的形式存在于细胞胞浆，当心肌细胞膜受损时，cTnI可通过心肌细胞膜进入血液循环系统[13]。已有研究[14-15]表明，丙泊酚对老年犬MI/RI损伤时的心肌具有保护作用以及心肌再灌注损伤，与本研究结果相似，表明丙泊酚对大鼠MI/RI损伤具有改善作用。

MI/RI损伤不仅会引起心肌组织细胞结构、功能发生改变，还会引起机体的氧化应激反应[16]。本研究结果显示，MI/RI损伤大鼠的心肌组织中的SOD活性降低，MDA水平、LDH活性升高，而丙泊酚干预可以降低MDA水平及LDH活性，提高SOD活性。正常生理状态下的心肌细胞中含有少量的氧自由基可被自由基清除系统清除，不会对心肌细胞产生损伤。缺血缺氧时，机体自由基产生和清除系统动态平衡失调，自由基生成能力提高，自由基清除能力降低，恢复血供后可诱导自由基含量增多，提高氧化应激反应。MDA是具有细胞毒性的脂质氧化产物，LDH是能够反应细胞膜损伤程度的糖原溶解酶。SOD活性降低时，细胞膜中不饱和双键结构容易被自由基破坏，促进脂质降解产生MDA，改变细胞通透性，诱导线粒体功能障碍[17]。本研究结果说明丙泊酚对MI/RI损伤大鼠心肌损伤的改善作用，可能与降低心肌组织的过度氧化应激反应有关。

本研究结果显示，MI/RI损伤大鼠的心肌组织中Nrf2、HO-1蛋白水平降低，而丙泊酚干预可以在一定程度上提高Nrf2、HO-1蛋白水平。Nrf2信号通路在机体抵抗外界氧化、化学等刺激的防御中具有重要作用，在机体内源性抗氧化应激系统中占据重要地位，被认为是氧化应激调控的核心枢纽。当机体收到外界有害刺激时，可刺激Nrf2活化并进入细胞核，与ARE结合并启动ARE下游抗氧化蛋白等基因的转录和表达。HO-1是Nrf2信号通路中的关键靶蛋白，在抗氧化应激过程中具有正向调节作用。本研究结果说明丙泊酚降低MI/RI损伤大鼠心肌组织氧化应激反应，可能与调节Nrf2信号通路活化有关。此外，本研究结果还发现，MI/RI损伤大鼠心肌组织中P62蛋白水平降低，LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白升高，而丙泊酚干预可以逆转这种趋势，P62是与蛋白质泛素化密切相关的一种泛素结合蛋白，可参与细胞信号转导、自噬过程[18]。自噬可以促进LC3-I转化为LC3-II，LC3-II水平与自噬体数量呈正比。Beclin1是调节自噬的关键蛋白之一，可通过与相关蛋白结合产生的复合体诱导细胞自噬。已有研究[19-20]表明，丙泊酚可以减轻因氧糖剥夺产生过度自噬的星形胶质细胞损伤和肝脏缺血再灌注损伤，与本研究结果一致，说明丙泊酚对MI/RI大鼠心功能保护作用可能与降低心肌组织过度自噬有关。

综上所述，丙泊酚可以改善大鼠MI/RI损伤和心肌组织过度自噬，还能降低心肌组织氧化应激反应，可能与调节Nrf2信号通路有关，其具体作用机制还需要深入研究。