大叶千斤拔叶黄酮的超声—微波协同提取工艺及其抗氧化活性研究

熊建文　李俊琦　梁莹　谢琳　孙松　蔡锦源　韦坤华

摘要：【目的】开展大叶千斤拔叶黄酮（Flemingia macrophylla leaf flavonoids，FMLF）的超声—微波协同提取工艺及其抗氧化活性研究，为FMLF的进一步综合开发利用提供数据基础。【方法】以FMLF得率为优选指标，固定超声波功率50 W，采用单因素试验考察乙醇体积分数、液料比、浸泡时间、微波功率和提取时间对FMLF得率的影响，并采用正交设计表L16（45）优选FMLF的超声—微波协同提取工艺，同时测定FMLF清除羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O[-2]·）、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）和亚硝酸盐的能力，以评价其体外抗氧化活性。【结果】各因素影响超声—微波协同提取FMLF效果的排序为：乙醇体积分数>微波功率>液料比>浸泡时间>提取时间，且乙醇体积分数、微波功率和液料比对FMLF提取效果有显著影响（P<0.05）。优选的FMLF提取条件为：乙醇体积分数60%、液料比21∶1（mL/g）、浸泡时间8 min、微波功率400 W、提取时间180 s，在此工艺条件下FMLF得率可达60.25 mg/g，且超声—微波协同提取效率优于单独超声和单独微波提取。在试验范围内，FMLF对·OH、O[-2]·、DPPH·和亚硝酸盐的清除作用与FMLF质量浓度均存在明显的量效关系，FMLF对·OH、O[-2]·、DPPH·和亞硝酸盐的清除率最高分别达73.05%、73.82%、82.54%和93.04%，其半数清除浓度（IC50）分别为1.42、2.88、0.66和1.24 mg/mL。【结论】正交试验优化的超声—微波协同提取法可用于FMLF的提取，FMLF具有一定的抗氧化活性，可作为天然的抗氧化剂进行开发。

关键词： 大叶千斤拔;黄酮;超声—微波协同提取;抗氧化活性

中图分类号： S184                                    文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）01-0198-08

Abstract：【Objective】The ultrasonic-microwave collaborative extraction process of Flemingia macrophylla leaf flavonoids（FMLF） was investigated in this study. Meanwhile，the antioxidant activity of FMLF was studied to provide data basis for the further comprehensive development and utilization of FMLF. 【Method】FMLF yield as optimizing targets，fixing ultrasonic power as 50 W，the single factor experiment was adopted to investigate the influence of ethanol concentration，liquid-solid ratio，soaking time，microwave power and extraction time on FMLF yield. Orthogonal design table L16（45） was used to optimize ultrasonic-microwave collaborative extraction process of FMLF，and its ability to remove hydroxyl radical （·OH），superoxide anion radical（O[-2]·），1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH·） and nitrite was measured， in order to evaluate its antioxidant activity in vitro. 【Result】The order of various factors affecting the ultrasonic-microwave synergistic extraction process was： ethanol concentration>microwave power>liquid-solid ratio>soaking time>extraction time，and ethanol volume fraction，microwave power and liquid-solid ratio had significant effects on the extraction effect of FMLF（P<0.05）. The optimized extraction condition of FMLF was as follows： ethanol concentration 60%，liquid-solid ratio 21∶1（mL/g），soaking time 8 min， microwave power 400 W，and extraction time 180 s. Under this process condition，the FMLF yield reached 60.25 mg/g，and the efficiency of ultrasonic-microwave collaborative extraction was better than that of the ultrasonic and microwave extraction alone. Within the scope of the experiment，the scavenging effect of FMLF for ·OH，O[-2]·，DPPH· and nitrite showed obvious concentration-response relationship with FMLF mass concentration. Clearance rates of FMLF for ·OH，O[-2]· and DPPH· and nitrite were 73.05%，73.82%，82.54% and 93.04%，respectively，and half scavenging concentration（IC50） were 1.42，2.88，0.66 and 1.24 mg/mL，respectively. 【Conclusion】The ultrasonic-microwave collaborative extraction method optimized by  orthogonal test can be used for the extraction of FMLF.  FMLF has certain antioxidant activity and can be used as a natural antioxidant.

Key words： Flemingia macrophylla; flavone; ultrasonic-microwave collaborative extraction; antioxidant activity

Foundation item： Guangxi Natural Science Foundation（2016GXNSFBA380025）; Guangxi University Teachers Basic Ability Improvement Project（2018KY0870，2019KY1107）; Scientific Research and Innovation Project of Lushan College， Guangxi University of Science and Technology（2018LSTD02）

0 引言

【研究意义】大叶千斤拔（Flemingia macrophylla）又名千斤力、千金红、大猪尾、老鼠尾和白马屎等，是豆科千斤拔属植物，收录于2015版《中国药典》（梁莹等，2017）。其根是我国西南少数民族常用的药物（蔡锦源等，2016），具有很高的营养和药用价值，富含多种天然雌激素如染料木素和染料木苷等多种黄酮类化合物，具有镇痛、抗炎和祛风活血等功效（Lai et al.，2013;Wang et al.，2017）。因此，进行大叶千斤拔黄酮的提取及其抗氧化活性研究，对大叶千斤拔的综合利用具有重要意义。【前人研究进展】目前，提取千斤拔总黄酮的方法主要有水浸提法、乙醇回流提取法、微波辅助萃取法和超声提取法等，提取效率较高、操作简便。年晓莉等（2008）采用水浸提法对蔓性千斤拔总黄酮进行提取，最佳提取工艺为：料液比1∶30（g/mL，下同），于75 ℃条件下水提3 h，提取3次。任朝琴和刘圆（2009）采用乙醇回流提取法对千斤拔总黄酮进行提取，最佳工艺参数为：回流时间3 h、料液比1∶14、乙醇体积分数50%、提取2次。陈帅和王慧竹（2011）采用正交试验优化获得超声辅助提取千斤拔总黄酮的工艺条件为：乙醇体积分数80%、提取时间25 min、料液比1∶20、提取2次。陈鹏等（2012）采用星点设计—效应面法优化千斤拔的回流提取工艺，最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数60%～80%、溶媒比24～26倍、提取时间180～240 min、提取2次。陈帅等（2013）采用正交试验法优化千斤拔总黄酮微波提取工艺，在最佳提取工艺条件（乙醇体积分数60%、微波功率500 W、微波时间60 min、料液比1∶15、微波温度65 ℃）下，获得千斤拔总黄酮提取率为1.146%。陈帅等（2015）采用微波辅助双水相提取千斤拔总黄酮，在最佳工艺条件（乙醇体积分数41%、硫酸铵加入量0.28 g/mL、微波时间21 min、微波功率550 W）下，千斤拔总黄酮得率为6.64%。蔡锦源等（2016）采用均匀设计与正交设计联用优选大叶千斤拔的微波辅助提取工艺，得到最佳提取工艺条件：微波功率700 W、提取温度80 ℃、解析剂水用量7∶1（mL/g）、微波时间120 s、液料比35∶1（mL/g，下同）、提取时间50 min。王岩等（2017）采用乙醇回流提取法对蔓性千斤拔总黄酮进行提取，并测定提取物对1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）和羟自由基（·OH）的抗氧化性能，结果表明，在提取时间20 min、料液比1∶4、乙醇体积分数80%、提取温度80 ℃的条件下，获得提取物的黄酮含量为0.92 mg/mL;提取物对DPPH·的清除率与抗壞血酸相当，对·OH具有一定的清除效果。李楠等（2019）采用乙醇加热回流法提取蔓性千斤拔总黄酮，最佳提取工艺为：乙醇体积分数90%、提取温度100 ℃、提取时间60 min、提取2次。【本研究切入点】目前有关大叶千斤拔的研究主要集中在根部，其茎叶不作为药用部位故研究较少，少数用于牲口饲料，绝大部分当作废弃物被遗弃，有关大叶千斤拔叶黄酮（F. macrophylla leaf flavonoids，FMLF）的提取及其生物活性研究尚属空白。【拟解决的关键问题】通过单因素和正交试验优选FMLF的超声—微波协同提取工艺条件，并对FMLF的体外抗氧化活性进行研究，以期为FMLF的进一步综合开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用大叶千斤拔叶子产自南宁，由广西药用植物园提供，经韦坤华研究员鉴定为豆科植物大叶千斤拔的叶子;乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、醋酸钾、氢氧化钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、双氧水、DPPH、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、硫酸亚铁和水杨酸等均为国产分析纯。主要仪器设备：UV2600紫外可见分光光度计（日本岛津公司）;JY1002（0.01 g）电子天平（上海精密科学仪器有限公司）;FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;CW-2000型超声—微波协同萃取仪（超声波功率/频率50 W/40 KHz，微波功率/频率0～1000 W（任意可调）/2450 MHz），DZF-6090真空干燥箱（北京中科博达仪器科技有限公司）;HH-S21-6数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）;TDL-80-2B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 FMLF提取工艺 将新鲜采摘的大叶千斤拔叶子45 ℃真空干燥至恒重，粉碎后过60目筛备用。准确称取粉末3 g放入圆底提取瓶中，按一定比例加入提取溶剂，静止浸泡一定时间后进行超声—微波协同提取，提取结束后过滤，所得滤液即为粗提物，用于测定黄酮含量及抗氧化活性。

1. 2. 2 FMLF含量测定 参考张林涛等（2011）的方法，采用紫外分光光度法测定。称取试剂芦丁0.010 g，用无水乙醇加热溶解后定容至50 mL容量瓶中，配制标准品溶液。取标准品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2和1.6 mL分别置于试管中，用蒸馏水稀释至5.0 mL，充分振荡摇匀;分别取0.5 mL稀释后不同质量浓度标准溶液或稀释后的样品置于试管中，加0.1 mL 10%硝酸铝，充分振荡摇匀;再加入0.1 mL 1 mol/L醋酸钾，充分振荡摇匀后加入3.0 mL 80%乙醇，充分振荡摇匀，避光静置40 min;显色后在紫外可见分光光度计415 nm处测其吸光值，做3组平行，取平均值。以芦丁质量浓度作横坐标、吸光值作纵坐标，绘制芦丁标准曲线。根据黄酮标准回归方程及公式（1）和公式（2）计算黄酮得率：

W=T×V×C/103  （1）

X=W/M  （2）

式中，W为黄酮含量（mg），T为提取液的稀释倍数，V为提取液体积（mL），C为由标准曲线计算得的质量浓度（?g/mL），X为FMLF得率（mg/g），M为样品投料量（g）。

1. 2. 3 单因素试验 称取经粉碎过筛的大叶千斤拔叶粉末3 g，按液料比加入一定量提取溶剂，静止浸泡一定时间后开启超声开关，超声波功率固定为50 W，选择影响FMLF得率的5个主要因素进行考察，各因素考察水平分别为：乙醇体积分数40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，液料比9∶1、12∶1、15∶1、18∶1、21∶1、24∶1和27∶1，浸泡时间0、2、4、6、8和10 min，微波功率0、100、200、300、400、500和600 W，提取时间60、90、120、150、180、210和240 s。

1. 2. 4 正交试验设计 在单因素试验的基础上，采用正交设计表L16（45）对超声—微波协同提取的影响因素进行正交试验设计，试验因素与水平见表1。

1. 2. 5 对比试验 在优选的工艺基础上，比较单独超声提取法、单独微波提取法和超声—微波协同提取法对FMLF得率的影响。单独超声提取法工艺条件为：超声功率50 W、乙醇体积分数60%、液料比21∶1、浸泡时间8 min、提取时间180 s;单独微波提取法工艺条件为：乙醇体积分数60%、液料比21∶1、浸泡时间8 min、微波功率400 W、提取时间180 s。

1. 2. 6 FMLF体外抗氧化活性测定 将最优提取工艺获得的FMLF进行稀释，并制备成FMLF质量浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.2、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mg/mL的溶液。采用王彦兵等（2019）的Fenton修正法测定FMLF对·OH的清除率，采用张英华和关雪（2012）的邻苯三酚自氧化法测定FMLF对超氧阴离子自由基（O[-2]·）的清除率，参照陈博文等（2019）的方法测定FMLF对DPPH·的清除率，参照莫晓宁等（2019）的方法测定FMLF对亚硝酸盐的清除率。

1. 3 统计分析

利用Excel 2019和正交设计助手V3.1对试验数据进行处理及分析，用Origin 8.0绘图。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 乙醇体积分数对FMLF得率的影响 固定浸泡时间6 min、液料比18∶1、微波功率300 W、提取时间180 s，考察乙醇体积分数对FMLF得率的影响，结果见图1。由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，FMLF得率呈先升后降的变化趋势，乙醇体积分数为60%时达最大值，显著高于40%、90%和100%的FMLF得率（P<0.05，下同）;当乙醇体积分数超过60%后，FMLF得率降低。试验发现高浓度乙醇在反应器中呈现液态的量较少，原因可能是高浓度乙醇较易在微波和超声波作用下大量挥发，削弱了溶剂溶解有效成分的能力，故乙醇体积分数以60%为宜。

2. 1. 2 液料比对FMLF得率的影响 固定乙醇体积分数60%、浸泡时间6 min、微波功率300 W、提取时间180 s，考察液料比对FMLF得率的影响，結果见图2。由图2可知，随着液料比的增加，FMLF得率也呈先升后降的变化趋势，当液料比为18∶1时达最大值，液料比超过18∶1后，FMLF得率反而降低。原因可能是适当增加液料比有利于黄酮溶出，液料比过大则不利于微波和超声波的作用，反而减少黄酮得率，故液料比以18∶1为宜。

2. 1. 3 浸泡时间对FMLF得率的影响 固定乙醇体积分数60%、液料比18∶1、微波功率300 W、提取时间180 s，考察浸泡时间对FMLF得率的影响，结果见图3。由图3可知，大叶千斤拔叶粉末经浸泡后黄酮得率显著高于未浸泡的黄酮得率，且随着浸泡时间的延长，FMLF得率先快速增加，浸泡时间超过6 min后，FMLF得率增加不明显，基本趋于平稳。从节约时间和提高效率角度出发，浸泡时间以6 min为宜。

2. 1. 4 微波功率对FMLF得率的影响 固定乙醇体积分数60%、浸泡时间6 min、液料比18∶1、提取时间180 s，考察微波功率对FMLF得率的影响，结果见图4。由图4可知，微波作用可显著提高FMLF得率，在低功率阶段，增加微波功率，FMLF得率提高明显，微波功率为300 W时达最大值，微波功率超过300 W后，FMLF得率反而快速降低。原因可能是适当增加微波功率有利于提高微波热效应，促进黄酮类物质溶出，当微波功率过大时，则较容易导致溶剂汽化程度增加，溶剂溶解能力下降，黄酮得率反而减少，故微波功率以300 W为宜。

2. 1. 5 提取时间对FMLF得率的影响 固定乙醇体积分数60%、浸泡时间6 min、液料比18∶1、微波功率300 W，考察提取时间对FMLF得率的影响，结果见图5。由图5可知，随着提取时间的延长，FMLF得率呈先升后降的变化趋势，当提取时间为180 s时达最大值，之后FMLF得率有所降低。原因可能是适当延长提取时间，相当于增强微波和超声波的作用，有利于黄酮类化合物溶出，但当提取时间过长时，微波作用更强，反而引起溶剂大量挥发而降低溶解能力，最终导致黄酮得率降低，故提取时间以180 s为宜。

2. 2 正交试验结果

由表2正交试验结果可知，5个因素对超声—微波协同提取FMLF的影响排序为：乙醇体积分数（A）>微波功率（D）>液料比（B）>浸泡时间（C）>提取时间（E），最优工艺组合为A2B4C4D3E2，即乙醇体积分数60%、液料比21∶1、浸泡时间8 min、微波功率400 W、提取时间180 s。方差分析结果（表3）表明，因素A、B和D对FMLF提取工艺具有显著影响，而C和E影响不显著（P>0.05）。按最优工艺条件进行3次提取试验，FMLF平均得率为60.25 mg/g，高于正交表的任一组合，表明试验方案设计稳定、可行。

2. 3 不同方法提取FMLF的效果對比分析

由图6可知，超声—微波协同提取FMLF的得率显著高于单独超声提取和单独微波提取，其FMLF得率分别是单独超声提取和单独微波提取的1.55倍和1.16倍。表明超声—微波协同技术将振动超声与开放式微波两种作用方式相结合，利用两种提取方法的优势，具有高效率特点。

2. 4 FMLF体外抗氧化活性测定结果

由图7可知，FMLF对·OH、O[-2]·、DPPH·和亚硝酸盐均具有良好的清除作用，且在试验范围内，FMLF对4种体外抗氧化自由基的清除活性均存在明显的量效关系，当FMLF质量浓度为12.0 mg/mL时，FMLF对亚硝酸盐、·OH、O[-2]·和DPPH·的清除率分别达93.04%、73.05%、73.82%和82.54%。

参考蔡锦源等（2017）的方法，分别取前5组数据进行线性回归，所得结果见表4。由表4可知，在低浓度下FMLF质量浓度与4种体外抗氧化活性指标的判定系数R2均接近1，该值越接近1，说明模型的拟合优度越高。FMLF对·OH、O[-2]·、DPPH·和亚硝酸盐的半数清除浓度（IC50）分别为1.42、2.88、0.66和1.24 mg/mL。

3 讨论

超声辅助是提取植物总黄酮的常用方法，其作用机理主要是利用超声波的热效应、机械粉碎作用及空化作用等，热效应使植物内部组织的温度迅速升高，有利于被提取物中有效成分流出，超声波的机械粉碎作用能引起细胞结构损伤，使组织细胞内活性物质释放、扩散及溶解，以提高黄酮类化合物的提取量（孙艳和杨志伟，2016;宋志姣等，2020;王彦兵等，2020）。微波辅助也是提取植物总黄酮的常用方法，在微波提取过程中，浸入到植物原料中的溶剂分子吸收微波，热运动加剧，温度升高破坏细胞壁，使细胞内物质溶出，而在电磁场作用下，有效成分随溶剂加速从被萃取的物料内部向外部溶剂中扩散，以提高黄酮类化合物的提取量（Cheng et al.，2013;刘韬等，2015）。本研究以FMLF得率为优选指标，参照大叶千斤拔根黄酮提取工艺的主要影响因素，选取乙醇体积分数、液料比、浸泡时间、微波功率和提取时间5个因素进行单因素试验，在单因素试验的基础上进行正交试验设计，并采用直观分析和方差分析优选FMLF的超声—微波协同提取工艺参数，得到的最佳工艺条件为：乙醇体积分数60%、液料比21∶1、浸泡时间8 min、微波功率400 W、提取时间180 s，该工艺条件下FMLF得率可达60.25 mg/g，优于陈帅等（2013）采用正交试验法优化千斤拔总黄酮微波提取工艺的结果。此外，超声—微波协同提取FMLF显著优于单独微波提取法和单独超声提取法。该技术将振动超声与开放式微波两种作用方式相结合，充分利用超声振动的空化作用及微波的高能作用，使样品各点内受到的作用一致，从而降低目标物与样品基体的结合力，加速目标物从固相进入溶剂中（庞敏等，2016;Xu et al.，2018;唐雅瑜等，2019），有利于FMLF得率的提高。

目前有关大叶千斤拔黄酮的提取及活性研究主要原料是根部（蔡锦源等，2016;王岩等，2017），而对其茎叶中黄酮的提取及活性研究未见报道。本研究对FMLF进行提取，并研究其抗氧化活性，结果发现其对·OH、O[-2]·、DPPH·和亚硝酸盐均具有良好的清除活性，且在试验范围内，FMLF对4种体外抗氧化自由基的清除活性均存在明显的量效关系，当FMLF质量浓度为12.0 mg/mL时，FMLF对亚硝酸盐、·OH、O[-2]·和DPPH·的清除率分别达93.04%、73.05%、73.82%和82.54%，IC50分别为1.42、2.88、0.66和1.24 mg/mL，表明FMLF与大叶千斤拔根的黄酮一样，具有一定的抗氧化性，可作为一种天然的抗氧化活性剂，但其清除机理及其他方面的生物活性有待进一步研究。

4 结论

采用正交试验设计法优化的超声—微波协同提取工艺条件（乙醇体积分数60%、液料比21∶1、浸泡时间8 min、微波功率400 W、提取时间180 s）可用于FMLF的提取，该法提取FMLF优于单独微波提取法和单独超声提取法，且提取得到的FMLF具有较强的抗氧化能力，可开发作为一种天然抗氧化剂。

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（責任编辑 罗 丽）