芡种壳多酚超声辅助提取工艺优化及其对金黄色葡萄球菌的抑制效果

张柳婷　吕金月　张港　李亚涛　蔡梅红　段玉清

摘要：【目的】優化芡种壳多酚提取工艺，并分析其对金黄色葡萄球菌的抑制作用和抑菌稳定性，为芡种壳的资源化利用提供参考依据。【方法】采用超声辅助法提取芡种壳多酚，以多酚提取率（Y）为评价指标，对超声时间（X1）、超声温度（X2）和料液比（X3）3个因素进行单因素和响应面试验，确定最佳提取工艺，初步纯化;采用琼脂扩散法研究芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌的抑制活性，并测定最小抑菌浓度（MIC），同时考察温度、pH及金属离子浓度对芡种壳多酚稳定性的影响。【结果】3个因素对芡种壳多酚提取率影响的大小为：超声温度>料液比>超声时间，料液比及超声温度与料液比的交互作用对芡种壳多酚提取率有显著影响（P<0.05），超声温度对多酚提取率有极显著影响（P<0.01）。得到回归方程Y=14.57+0.064X1+0.26X2+0.11X3+0.079X1X2-0.018X1X3-0.18X2X3-0.11X12-0.54X22-0.19X32;最佳提取工艺为：超声时间39 min、超声温度72 ℃、料液比1∶41，在此条件下，芡种壳多酚提取率为14.479%，与预测值（14.630%）接近;芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用，MIC为0.1625 mg/mL;温度及Ca2+、Mg2+、K+、Na+ 4种金属离子对芡种壳多酚抑制金黄色葡萄球菌活性不具有显著影响（P>0.05），而随着pH的增加，芡种壳多酚抑菌活性受到抑制。【结论】采用优化的超声辅助法可有效提取芡种壳中多酚物质，提取到的多酚对金黄色葡萄球菌的生长具有良好且较稳定的抑制效果。

关键词： 芡种壳;多酚;超声辅助法;抑菌;金黄色葡萄球菌

中图分类号： S509.9                                文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）01-0189-09

Abstract：【Objective】The extraction technology of polyphenols from Euryale ferox seed shell was optimized， and its inhibition and stability to Staphylococcus aureus were analyzed to provide basis for resource utilization of E. ferox seed shell. 【Method】The ultrasonic assisted extraction method was used to extract the polyphenols from E. ferox seed shell. The single factor experiment and response surface experiment with extraction yield of polyphenols（Y） as the evaluation index， and the ultrasound time（X1）， ultrasound temperature（X2） and soild-liquid ratio（X3） as three factors were carried out to determine the best extraction process， then the extract was preliminarily purified by macroporous resin. The inhibitory activity and the minimum inhibitory concentration（MIC） of E. ferox seed shell polyphenols on S. aureus was studied by agar diffusion method. The effects of temperature，pH and metal ion concentration on the stability of polyphenols were also investigated. 【Result】The effects of three factors on yield of polyphenols from E. ferox seed shell were：ultrasound temperature>solid-liquid ratio>ultrasound time，the results showed that the solid-liquid ratio， and the interaction between ultrasound temperature and solid-liquid ratio had significant effects on yield of polyphenols（P<0.05）， while the ultrasound temperature had extremely significant effects（P<0.01） on the extraction rate of polyphenols from E. ferox seed shell. The regression equation was obtained：Y=14.57+0.064X1+0.26X2+0.11X3+0.079X1X2-0.018X1X3-0.18X2X3-0.11X12-0.54X22-0.19X32. The optimum extraction process was： ultrasound time was 39 min，ultrasound temperature was 72 ℃，solid-liquid ratio was 1∶41. Under these conditions，the extraction rate was 14.479%， which was close to the predicted value（14.630%）. E. ferox  seed shell polyphenol had certain inhibitory effect on S. aureus，the MIC was 0.1625 mg/mL. The temperature and Ca2+， Mg2+， K+ and  Na+  metal ions had no significant effect on the inhibition of S. aureus reproductive activity by E. ferox seed shell polyphenols（P>0.05）， but with the increase of pH， the bacteriostatic activity of E. ferox seed shell polyphenols was inhibited. 【Conclusion】The polyphenols in the shell of E. ferox can be effectively extracted by the optimized ultrasonic assisted method，and the polyphenols has a good and stable inhibitory effect on the growth of S. aureus.

Key words： Euryale ferox seed shell; polyphenols; ultrasonic assisted method; antimicrobial activity; Staphylococcus aureus

Foundation item： Jiangsu Modern Agriculture Industrial Technical System Project（JATS〔2019〕469）

0 引言

【研究意义】芡（Euryale ferox）为双子叶植物纲睡莲科一年生大型水生草本植物，俗称鸡头、肇实和雁头。芡的种子包括种壳（芡种壳）和种仁（芡实）两个部分，其中，芡实主要组分为淀粉（王晶，2011;刘志国和赵文亚，2012;Zhang et al.，2019），还富含蛋白质（张名位等，1999;黎卫，2015）、多酚（Liu et al.，2013）、矿物质（张名位等，1999）和维生素等物质，其味甘，性平，主治湿痹、腰脊膝痛，补中，除暴疾，益精气，强志，是一种传统药食同源的食材;芡种壳是芡实种仁外一层厚1～2 mm的坚硬外壳，占芡种子质量的40%～50%。目前在芡的加工过程中，大量芡种壳被当作废弃物烧毁，或被丢弃后占用耕地堆放腐烂，且日晒雨淋，酸性物质污染土壤和河流，造成土地酸化，导致严重的环境问题;芡种壳中含有丰富的多酚（张汆等，2015）、萜类（Yuan et al.，2014）和矿物元素（陈德义等，2015），这些活性物质未得到合理利用，造成很大的资源浪费。因此，若能提取芡种壳中的多酚物质，研究其抑菌活性，进一步将其应用于食品防腐保鲜等领域，对芡种壳的资源化利用具有重要意义。【前人研究进展】目前对芡生理活性物质提取及其活性的研究已有不少相关报道。芡实的提取物可通过调节线粒体膜电位和活性氧的产生诱导A549癌细胞的凋亡（Nam et al.，2019）;芡实的乙酸乙酯提取物可抑制小鼠黑色素的产生（Baek et al.，2015），其石油醚提取组分对小鼠抑郁有一定抵抗作用（Huang et al.，2018）;此外，芡的一些成分具有明显抗氧化活性，Liu等（2013）采用响应面法提取肇芡种壳中的多酚，研究发现其具有一定抗氧化作用;从芡叶柄和花梗中提取的多糖和种子中提取得到的奎宁均可通过清除自由基起到调节血糖、预防糖尿病的功效（Song et al.，2011;Wu et al.，2017），对心肌缺血再灌注损伤也有一定效果（Das et al.，2006）;相关研究还表明芡种壳乙醇提取物中富含的三萜类物质对糖尿病具有治疗效果（Yuan et al.，2014）。对芡抑菌活性方面的研究，李成良（2011）研究发现芡实的醇提物对金黄色葡萄球菌等8种菌株均有不同程度的抑菌效果;黎卫（2015）对芡实蛋白进行提取，发现SDS处理的清蛋白对大肠杆菌抑制作用良好;张汆等（2015）对不同溶剂芡种壳提取物的抑菌活性进行分析，发现乙酸乙酯提取物较乙醇提取物和水提取物的抑菌活性更强，并发现几种提取物对大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌和单增李斯特菌均表现出较强的抑菌活性。【本研究切入点】近年来，植物多酚的抑菌活性受到国内外学者的广泛关注，其抑菌效果得到广泛认同（赵毅，2015;Xiong et al.，2017），但针对芡种壳中活性成分多酚提取工艺及其抑菌活性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用响应面法优化超声辅助提取芡种壳中多酚物质的工艺条件，以常见的食品腐败菌——金黄色葡萄球菌为典型菌种，研究芡种壳多酚对其的抑制作用，同时考察温度、pH及金属离子浓度对芡种壳多酚抑菌活性稳定性的影响，为芡种壳多酚在抑制食品腐败相关细菌的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

芡种壳购自安徽芡实大市场，烘干粉碎后过100目筛备用;金黄色葡萄球菌ATCC6538由江蘇大学食品与生物工程学院实验室保存;AB-8树脂购自东鸿化工有限公司，无水乙醇、无水碳酸钠、氯化钠和琼脂粉等试剂均为国产分析纯，福林酚购自上海源叶生物科技有限公司。主要仪器设备：发散式三频平板式超声设备（江苏大学自制）、VIS-7220N可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）、药材调料高速粉碎机（温岭市百乐粉碎设备厂）和恒温摇床（上海福玛实验设备有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 多酚含量测定

1. 2. 1. 1 标准曲线绘制 以没食子酸为标准品，采用福林酚法（Singleton et al.，1999）测定总酚含量。配制1 mg/mL没食子酸标准品，分别稀释得到质量浓度为10、20、30、40、50和60 μg/mL的没食子酸溶液，分别吸取500 μL不同质量浓度的没食子酸溶液，加入2.5 mL 10%福林酚试剂，在1～8 min内加入2.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，充分混匀后室温下避光1 h显色，在760 nm波长下测其吸光值。绘制标准曲线，得到线性回归方程y=0.0101x+0.0514（R2=0.9986）。

1. 2. 1. 2 多酚提取率计算 吸取一定量提取液，稀释一定倍数，吸取其中500 μL稀释液，加入2.5 mL 10%福林酚试剂，在1～8 min内加入2.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，充分混匀后室温下避光1 h显色，在760 nm波长下测其吸光值。根据标准曲线计算得到多酚质量浓度，按下式计算提取率：

多酚提取率（%）=[C×V×N×10-6m]×100

式中，C为芡种壳多酚质量浓度（μg/mL），V为提取液体积（mL），N为稀释倍数，m为芡种壳质量（g）。

1. 2. 2 单因素试验 准确称取0.500 g芡种壳粉置于一定体积的水溶液中，在频率40 kHz、功率300 W的超声条件下提取一定时间。以8000 r/min速率进行离心，取上清液，测定多酚质量浓度，计算多酚提取率。以多酚提取率为评价指标，选择超声时间、超声温度和料液比3个因素进行单因素试验，考察各因素对超声条件下芡种壳多酚提取率的影响。

1. 2. 2. 1 超声时间对芡种壳多酚提取率的影响

分别设置超声时间为5、15、25、35和45 min，在超声频率40 kHz、超声温度40 ℃、料液比1∶40的条件下进行超声水提，计算多酚提取率。

1. 2. 2. 2 超声温度对芡种壳多酚提取率的影响

分别设置超声温度为30、40、50、60、70和80 ℃，在超声频率40 kHz、超声时间35 min、料液比1∶40的条件下进行超声水提，计算多酚提取率。

1. 2. 2. 3 料液比对芡种壳多酚提取率的影响 分别设置料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60，在超声频率40 kHz、超声温度70 ℃、超声时间35 min的条件下进行超声水提，计算多酚提取率。

1. 2. 3 响应面试验 根据Box-Benhnken的中心组合设计原则，以超声时间、超声温度和料液比3个因素为自变量，多酚提取率为响应值，设计3因素3水平共17个试验点的响应面分析试验，其中12个为析因试验，5个为中心试验。因素与水平见表1。

1. 2. 4 大孔树脂提纯 选用AB-8树脂对芡种壳多酚进行分离纯化。用95%乙醇浸泡AB-8树脂24 h，使其充分溶胀后，去离子水洗至无醇味;用5%盐酸浸泡8 h，去离子水洗至中性;用5%氢氧化钠浸泡8 h，去离子水洗至中性。去离子水浸没备用。树脂采用湿法装柱，稳定后上样，上样量200 mL，上样速度2 mL/min，充分吸附后以70%乙醇为洗脱剂进行洗脱，至流出液无样品颜色即洗脱完成。洗脱后的多酚溶液进行旋蒸挥发有机溶剂，冻干备用。

1. 2. 5 菌种活化及菌悬液制备 从-20 ℃冰箱取出保藏的金黄色葡萄球菌ATCC6538菌种，于LB固体培养基上划线活化，在生化培养箱中37 ℃培养过夜。进行抑菌试验前，将活化分离的菌种转接于液体培养基培养至对数期备用。

1. 2. 6 抑菌活性试验及最小抑菌浓度（MIC）测定

采用琼脂扩散法测定芡种壳多酚抑菌活性。具体操作参考Najdenski等（2013）的方法，略有修改：配制LB固体培养基，高压灭菌后冷却至50 ℃左右，按100 μL/150 mL比例混入培养好的菌液，混匀后倒平板，凝固后以灭菌的打孔器打孔。将冻干后的多酚配成2.6 mg/mL的多酚水溶液，倍比稀释，分别加入孔内，37 ℃培养箱中培养过夜，观察培养皿中细菌生长情况，记录抑菌圈直径，打孔器直径为6 mm，抑菌圈直径大于6 mm时表示有抑菌效果，能产生抑菌效果的最低样品浓度为MIC。

1. 2. 7 温度对芡种壳多酚抑菌效果的影响 以冻干粉配制3 mg/mL的多酚水溶液原液，将其分别在20、40、60、80、100和120 ℃下处理20 min，以琼脂扩散法分析芡种壳多酚抑菌活性的变化情况，比较抑菌圈大小，研究芡种壳多酚抑菌活性对不同温度的敏感性。

1. 2. 8 pH对芡种壳多酚抑菌活性的影响 以冻干粉配制3 mg/mL的多酚水溶液原液，调节pH，使其分别为2、4、6、7、8、10和12，以琼脂扩散法分析芡种壳多酚抑菌活性的变化情况，比较抑菌圈大小，研究芡种壳多酚抑菌活性对不同pH的敏感性。

1. 2. 9 金属离子对芡种壳多酚抑菌活性的影响

以冻干粉配制2 mg/mL的多酚水溶液原液，分别添加食品中常见的几种金属离子——Ca2+、K+、Na+和Mg2+，并调节各金属离子浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1.0 mol/L，以不加金属离子的多酚原液为对照，以琼脂扩散法分析芡种壳多酚抑菌活性的变化情况，比较抑菌圈大小，研究芡种壳多酚抑菌活性对不同金属离子的敏感性。

1. 3 统计分析

各试验数据均重复测定3次。采用SPSS 17.0对试验数据进行差异性分析和方差分析，采用Sigmaplot 10.0制图。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 超声时间对芡种壳多酚提取率的影响 由图1可知，随着超声时间的延长，芡种壳多酚提取率显著提高（P<0.05，下同），在35 min时达最大值，35 min后多酚提取率趋于平稳，无显著变化（P>0.05，下同）。说明随着超声时间的延长，溶液中的多酚浓度已达饱和，可溶出多酚已基本全部溶出。考虑到耗能问题，在后续试验中选择35 min的超声时间进行处理。

2. 1. 2 超声温度对芡种壳多酚提取率的影响 如图2所示，随着超声温度的升高，芡种壳多酚提取率显著提高，当超声温度超过70 ℃后，多酚提取率增加不显著。考虑到高温对多酚稳定性的影响及能耗问题，在后续试验中选择70 ℃的超声温度进行处理。

2. 1. 3 料液比对芡种壳多酚提取率的影响 如图3所示，料液比在1∶10～1∶40时，随着溶剂体积的增加，芡种壳多酚提取率显著提高，在料液比为1∶40时，多酚提取率达最大值;当料液比小于1∶40后，多酚提取率无显著提高，趋于平稳。在料液比为1∶40时芡种壳多酚的提取更经济，且过高的溶剂体积会增大后续提纯等试验过程的工作量，故在后续试验中选择料液比1∶40进行处理。

2. 2 响应面试验结果

2. 2. 1 模型的建立及显著性分析 应用Design-Expert V8.0.6对表2的试验数据进行分析，得到拟合方程：Y=14.57+0.064X1+0.26X2+0.11X3+0.079X1X2-0.018X1X3-0.18X2X3-0.11X12-0.54X22-0.19X32。

方差分析结果（表3）显示，上述回归方程的决定系数R2=0.9688，说明该模型拟合度较好，可以真实地描述各因子与响应值之间的关系;且失拟性（P=0.1472）不显著，说明回归方程和实际结果较吻合，试验误差小，因此可用该回归方程对试验结果进行分析。由表3还可知，超声温度对芡种壳多酚提取率的影响达极显著水平（P<0.01），料液比及超声温度与料液比的交互项达显著水平，超声时间与超声温度、超声时间与料液比的交互項不显著。

2. 2. 2 因素间的交互作用 固定料液比为1∶40时，超声温度与超声时间对芡种壳多酚提取率影响的响应面和等高线如图4所示。当超声温度固定时，随着超声时间的延长，芡种壳多酚提取率变化幅度较小;当超声时间固定时，随着超声温度的升高，芡种壳多酚提取率先升高后下降，变化幅度较超声时间大。超声温度在70～75 ℃、超声时间在35～45 min范围内出现最高响应值。

固定超声温度为70 ℃时，料液比与超声时间对芡种壳多酚提取率影响的响应面和等高线如图5所示。当料液比固定时，随着超声时间的延长，芡种壳多酚提取率增加至一定程度后相对稳定;当超声时间固定时，随着料液比的减小，芡种壳多酚提取率先升高后有小幅下降。料液比在1∶40～1∶45、超声时间在30～45 min范围内出现最高响应值。

固定超声时间为35 min时，料液比与超声温度对芡种壳多酚提取率影响的响应面和等高线如图6所示。料液比与超声温度的交互作用显著，当料液比固定时，随着超声温度的升高，芡种壳多酚提取率先升高后下降;当超声温度固定时，随着料液比的减小，芡种壳多酚提取率先升高后下降，变化幅度相比超声温度较小。料液比在1∶40～1∶45、超声温度在70～75 ℃范围内出现最高响应值。

2. 2. 3 工艺优化与验证试验结果 通过Design-Expert V8.0.6分析得出3个因素对超声过程中芡种壳多酚提取率的影响排序为：超声温度>料液比>超声时间。通过模型预测的最佳提取条件为：超声时间38.69 min、超声温度72.44 ℃、料液比1∶41.48，该预测模型最佳提取率为14.630%。为实际操作方便，提取条件修正为：超声时间39 min、超声温度72 ℃、料液比1∶41，在此条件下，芡种壳多酚提取率为14.479%，接近预测值，说明采用响应面法优化得到的芡种壳多酚超声提取条件可靠。

2. 3 MIC测定结果

由图7可知，芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌有抑制效果，在试验浓度范围内，抑菌作用随着多酚质量浓度的增大而增强;多酚质量浓度为0.0813 mg/mL时抑菌圈已无变化，以此法得到的芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌的MIC为0.1625 mg/mL。

2. 4 不同温度对芡种壳多酚抑菌效果的影响

温度对芡种壳多酚抑菌效果的影响如图8所示，芡种壳多酚经各个温度处理20 min后，对金黄色葡萄球菌的抑制效果无显著差异，说明在此情况下，芡种壳多酚的抑菌活性对温度并不敏感，相对稳定。

2. 5 不同pH对芡种壳多酚抑菌效果的影响

pH对芡种壳多酚抑菌效果的影响如图9所示，pH为6时，芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌的抑制效果最明显，在中性附近，其抑菌效果相对较好，而在偏酸和偏碱性时均有明显下降，尤其在碱性环境中抑菌活性最弱，可能与多酚物质在碱性条件下不稳定有关。

2. 6 不同金属离子对芡种壳多酚抑菌效果的影响

金属离子对芡种壳多酚抑菌效果的影响如图10所示，添加不同浓度金属离子时，芡种壳多酚的抑菌活性均无显著差异，可见Ca2+、Mg2+、K+和Na+ 4种常见的金属离子并不会对芡种壳多酚在食品中的抑菌效果造成影响。

3 讨论

本研究采用超声辅助法对芡种壳多酚进行提取，该方法是提取植物多酚常用手段之一，利用超声波在液体中的强烈振动及空化作用造成瞬时高温高压使细胞破裂，帮助溶剂进入细胞，提取目标物质。这种提取方法操作简便，缩短提取时间，提高提取效率，降低提取温度和能耗。在采用超声技术提取多酚时，影响提取效率的因素较多，超声时间、超声温度、超声频率、料液比等均会对其产生影响，其中，超声时间、料液比和超声温度在影响提取率的同时对大规模加工时的能耗也有较大影响。本研究在考虑实际生产能耗的基础上，固定40 kHZ超声频率和300 W功率进行响应面试验，使用蒸馏水为溶剂，对超声时间、料液比和超声温度3个因素进行优化，得到最优工艺为：超声时间39 min、超声温度72 ℃、料液比1∶41，在此条件下，芡种壳多酚提取率可达14.479%，与Liu等（2013）采用响应面法优化乙醇提取得到的肇庆芡种壳多酚提取率（15.69%）相近，可能与芡的品种有关，也可能与提取工艺中所采用的溶剂有关。

在对芡实的抑菌活性方面，李成良（2011）从芡实籽粒中提取的类黄酮成分对金黄色葡萄球菌表现出一定抑制作用;张汆等（2015）采用芡种壳提取物对多种菌种进行抑菌率测定，发现其对大肠杆菌、单增李斯特菌和葡萄球菌等均有一定的抑制效果。本研究也发现，芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌具有一定抑制作用。芡种壳多酚的MIC及其抑菌稳定性尚未见报道，本研究通过琼脂扩散法进行分析发现芡种壳多酚的抑制效果具有浓度依赖性，即抑制作用随着多酚质量浓度的减小而减弱，在多酚质量浓度从2.6000 mg/mL降至0.1625 mg/mL时，抑菌圈直径从18.3 mm缩小至7.1 mm，浓度降至0.0813 mg/mL后，不再有抑菌圈出现。经不同温度（20～120 ℃）处理，芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌的抑制效果未发生显著改变，表明对食品进行普通加热不会对芡种壳多酚在食品中的抑菌作用产生影响;添加0.1～1.0 mol/L的Ca2+、Mg2+、K+和Na+ 4种金属离子后，芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌的抑制效果也未发生明显变化，常见食品中这些离子含量大多不超过此范围，因此，常见食品的金属离子环境并不会影响芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌的抑制作用;在较高pH范围时，芡种壳多酚对金黄色葡萄球菌的抑制作用有明显下降，表明芡种壳多酚对碱性环境较敏感，可能是发挥活性的多酚物质在碱性环境下其结构发生变化（韩雯雯，2012）。

研究发现芡种壳中的多酚物质可能为绿原酸、儿茶素和没食子酸等（Liu et al.，2013;张汆等，2015）;已有大量研究表明绿原酸、儿茶素、没食子酸及其衍生物具有一定抑菌效果（Li et al.，2014;Wu et al.，2018;王娜等，2019），但芡种壳中发挥抑菌作用的活性物质是多酚物质还是多酚与其他物质的络合体，发挥活性的多酚是单种多酚还是多种多酚混合，需进一步试验探究。芡种壳多酚的抑菌机制也有待进一步研究。在经过安全试验验证后，芡种壳多酚有望作为一种天然食品防腐剂应用于食品中，为实现芡种壳的资源化利用提供一定理論依据。

4 结论

采用优化的超声辅助工艺条件（超声时间39 min、超声温度72 ℃、料液比1∶41）可有效提取芡种壳中多酚物质，提取到的多酚对金黄色葡萄球菌生长具有良好且较稳定的抑制效果，其活性对温度和Ca2+、Mg2+、K+、Na+ 4种金属离子相对稳定而对碱性环境相对敏感。

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（責任编辑 罗 丽）