冻融胚胎移植时间与子宫内膜转化时间对妊娠结局的影响

王余江，樊 琳，梁嘉颖，黄 莉，陈创奇，刘 顿，刘风华，张曦倩

(广东省妇幼保健院生殖医学中心，广州 511442)

自1983年冷冻胚胎移植(frozen embryo transfer，FET)技术应用到辅助生殖领域，不仅显著提高了累积临床妊娠率，也有效地预防了卵巢过度刺激综合征(ovarian hyper-stimulation syndrome，OHSS)风险的发生，同时促进了胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)和卵子冷冻等衍生技术的发展[1-2]。FET技术的优势日益突显，在临床上得到广泛应用，在全胚冷冻日趋升高的形势下，改善FET临床结局的意义重大[3]。成功植入与妊娠不仅需要具有发育潜能的整倍体胚胎，也需要同步发育的子宫内膜[4-5]。多数学者认为，FET周期将第3日(day 3，D3)胚胎移植到黄体酮补充3天的子宫内，可获得较稳定的临床妊娠率[6-8]。然而，在临床中总有一些不可避免的因素导致移入宫腔内的胚胎与子宫内膜发育不完全一致。因此，明确胚胎与孕酮作用内膜时间的关系，选择最佳的胚胎移植时机尤为重要。本研究选取FET周期激素替代方案(hormone replacement therapy，HRT)，系统性分析不同孕酮作用内膜时间与移植胚胎的临床结局，为临床选择最佳移植时机提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾分析2013年8月至2016年1月在广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症科行HRT-FET周期的1609例患者的临床结局。纳入标准：年龄22～38岁；激素替代周期；首次行FET周期。排除标准：异常子宫；经期孕酮大于1.0ng/ml；输卵管积水；促排周期和自然周期；染色体异常；拟行PGT者。

1.2 子宫内膜准备方案 对排卵障碍或月经周期不规律以及排卵期内膜<7mm的患者，于经期3～5天开始口服补佳乐4mg/d(戊酸雌二醇片，拜耳，德国)。用药7天后，B超监测子宫内膜变化，根据内膜形态、厚度予以评估并记录，结合当日激素水平适当调整用药剂量和方案。内膜厚度大于7mm时，每日肌内注射40～60mg黄体酮注射液。从注射黄体酮第1天记为孕酮作用内膜1天，择期选择冷冻胚胎复苏，适时移植。胚胎移植后继续给予至少14天的外源性黄体酮支持。按孕酮作用内膜时间-移植第几天胚胎分为：3-3组(孕酮作用内膜3天移植D3胚胎)，3-4组(孕酮作用内膜3天移植D4胚胎)，4-3组(孕酮作用内膜4天移植D3胚胎)和4-4组(孕酮作用内膜4天移植D4胚胎)。

1.3 胚胎评分与选择 按SART胚胎评分系统标准对卵裂期胚胎进行评分[9]，将细胞数、碎片和卵裂球均一度三个指标整合在一个胚胎评分中。选择细胞数目大于5，碎片小于25%，均一度中等或更好的作为冷冻选择标准，于D3采用快速玻璃化法冷冻，各组间均挑选冷冻时评分为优质胚胎进行复苏后移植。D3胚胎移植于当天解冻，培养2～4h后移植。D4胚胎移植于前日解冻，过夜培养后移植。

1.4 标准判断 种植率指行胚胎移植术后4周，B超下见到的孕囊总数占移植胚胎总数的百分比。临床妊娠是指胚胎移植4周后B超介导下子宫内可见孕囊且有胎心搏动。临床妊娠率指临床妊娠数占移植周期总数的百分比。早期流产率指12周之内自然流产数与临床妊娠数之比。持续妊娠率指连续12周处于宫腔内妊娠数与移植周期数之比。

2 结 果

2.1 患者基本特征 4组患者年龄、不孕年限、子宫内膜厚度、体质量指数(body mass index,BMI)和移植胚胎数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 患者的一般情况

2.2 孕酮作用内膜时间与移植胚胎同步的临床结局 3-3组的种植率(25.4%)明显低于4-4组(37.3%)(P<0.05)，临床妊娠率和持续妊娠率(37.5%和31.1%)低于4-4组(53.1%和46.5%)，但差异无统计学意义(P>0.05)。两组的早期流产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 不同移植胚胎时间的临床结局 孕酮作用内膜3天时，3-3组的种植率、临床妊娠率和持续妊娠率低于3-4组，差异无统计学意义(P>0.05)。孕酮作用内膜4天时，4-4组的种植率和临床妊娠率(37.3%，53.1%)均明显高于4-3组(23.4%，34.4%)(P<0.05)。见表2。

2.4 不同孕酮作用时间的临床结局 移植第3天胚胎时，3-3组与4-3组的种植率、临床妊娠率、持续妊娠率和早期流产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。移植第4天胚胎时，3-4组与4-4组的种植率、临床妊娠率、持续妊娠率和早期流产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组患者的临床结局比较

3 讨 论

随着低温生物学的发展，胚胎冷冻技术广泛应用于临床，FET的临床结局也备受关注。胚胎植入是一个高度复杂且受多因素影响的过程，成功的植入与妊娠需适当发育的整倍体胚胎与容受性内膜达到同步化[10]。在临床实践中，要达到这种同步化，一方面是植入胚胎时期的选择，另一方面是对子宫内膜容受性的准确评估与促进[11]。激素替代周期、促排周期和自然周期是冻融胚胎移植中应用最普遍的内膜准备方案，不同方案的妊娠结局无统计学意义[6,12]。HRT-FET是通过外源性雌、孕激素替代模拟人类正常月经周期，用药方便且无需对患者的卵泡发育情况进行持续监测，具有较强的操作性及可控性[13]。值得注意的是，HRT期间患者需持续依靠外源性的黄体支持[14]。研究表明，HRT周期中延长孕酮连续暴露内膜时间，可延长内膜容受期限，增加胚胎与内膜作用频次，从而获得更好的种植结局[15]。本研究结果显示，孕酮作用内膜时间和移植冻融胚胎同步时，4-4组的种植率显著高于3-3组。表明孕酮作用内膜4天同时移植第4天胚胎比孕酮作用3天同时移植第3天胚胎有更好的种植结局。

目前无论是新鲜移植周期还是冷冻移植周期，卵裂期胚胎移植主要以第3天为主[16]。郭艺红等[17]研究显示，孕酮作用于小鼠子宫内膜后，适当延迟胚胎移植时间仍可获得满意的妊娠结局。Tao等[18-19]研究表明，不同时期胚胎的非整倍体比例不同，6-10细胞阶段胚胎的非整倍体率高达60%，而发育到16-32细胞(桑椹胚)时的非整倍体率可降低一半，移植D4胚胎持续妊娠率明显高于D3。有研究表明，与D5囊胚移植相比，移植D4桑椹胚的妊娠结局无明显降低，并且较D3卵裂期胚胎植入更为有利，这是因为胚胎暴露于子宫环境的时间与自然生理状态更接近，且胚胎在解冻之后继续培养，有助于挑选卵裂球生长发育潜能更好的胚胎移植[20]。本研究结果提示，胚胎与孕酮作用内膜不同步的3-4组比胚胎与内膜同步的3-3组似乎有更好的妊娠结局。延迟孕酮作用时间与胚胎移植时机到第4天有更佳的临床结局，这可能与胚胎继续培养后的选择有关。

子宫内膜只有在短暂的“种植窗”期允许胚胎着床，而孕酮是开启种植窗的关键因素[21]。种植窗开放于黄体中期，在排卵后的6～8天子宫内膜容受性最大，此时是胚胎种植成功率最高阶段[22]。曹鹏燕等[23]研究发现，孕酮作用内膜一定时间内(3.5～5天)均可移植卵裂期胚胎，并且临床结局间无显著差别。杨柳等[24]研究表明，延长激素替代周期中雌、孕激素用药时间可刺激内膜达到理想状态,提高临床妊娠率。董梅等[25]研究发现，相对3天而言，黄体酮转化4天可能有更好的临床结局。本研究中，移植相同天数胚胎时，孕酮作用内膜3天和孕酮作用内膜4天具有相似的临床结局。

本研究结果与临床实践提示，同步孕酮作用内膜时间与移植胚胎时期是提高种植结局的关键，与常规的第3天卵裂期胚胎移植相比，两者同时延迟一天能获得更满意的妊娠结局。孕酮转化子宫内膜3～4天似乎是“平台期”，在“平台期”内移植同一时期的胚胎均可获得相似的临床结局。因此，HRT周期的冻融胚胎移植可更加灵活地安排临床和实验室工作。本研究样本量较小，有待扩大样本量并采用随机对照的方法进一步研究。